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Operation

Operation

ECL reagents의 selection guide 및 Western blotting 을 진행하면서 실험 관련 tips 그리고 Maintenance 정보가 포함되어 있습니다.

ecl_3_plex

Basic Operation

Maintenance

ECL 비교표

 
ECL start
ECL
ECL Prime
ECL Select
ECL Plex
제품 번호RPN3243 (2,000 ㎠)RPN2109 (1,000 ㎠)RPN2232 (1,000 ㎠)RPN2235 (1,000 ㎠)RPN998 (1,000 ㎠)
사용 목적다량 단백질 정성분석단백질 정성 분석소량 단백질의 정량 분석극소량 단백질 정량 분석Multiplexing 정성/정량분석
어플리케이션
(특징)
•일반적 화학발광 검출
• Tagged proteins
•일반적 화학발광 검출
•샘플, 항체가 충분하며
경제적으로 검출하는 경우
•소량단백질의 정성
•매우 정확한 정량 분석
•최고강도 검출•정량 분석
•다중 검출 (2 종류 이상의
샘플을 한 번에 검출)
•재 스캔 가능
검출
화학발광
형광
검출 장비
CCD 이미저 (Amersham Imageer 600, LAS500), X-선 필름
형광 이미저 (Typhoon,
Amersham Imager 600)
이미지
지속 시간*
< 3 시간< 2 시간< 24 시간< 46 시간최대 3 개월 (차광 시)
Amersham Protan
Amersahm Hybond-P, Amersham Protan
Amershan Hybond-LFP,
Amersham Protan Premium
블로킹제
Amersham ECL Blocking Agent (RPN2125), Amersham ECL Prime Blocking Agent (RPN418)
Amersham ECL Prime
Blocking Agent (RPN418)
1차항체**1:500~3,0001:500~10,0001:1,000~30,0001:5,000~30,0001:100~5,000
2차항체1:5,000~50,0001:5,000~50,0001:50,000~200,0001:100,000~300,0001:1,250~4,000
감도*> 1 ng> 10 pgECL의 80 배 감도 (max.)ECL의 200 배 감도 (max.)> 1.2 pg
ECL의 20배 감도 (max.)
결과이미지ecl_table_1_1ecl_table_1ecl_table_2ecl_table_3ecl_table_4

감도 발광시간은 실험 조건에 의해 변하는 경우가 있습니다 .
** 양질의 결과를 얻기 위해서는 샘플별로 조건 검토를 하여 적정 항체 농도를 결정할 필요가 있습니다 .

Basic Operation

Maintenance

ECL Maintenance
western 시간 단축을 위한 힌트
힌트① 막의 블로킹
50 분단축고농도의 블로킹제를 이용하는 것으로 시간단축이 가능합니다. 10% ECL Blocking Agent (RPN2125)를 포함하는 PBS-T 또는 TBS-T 를 이용하면, 10 분간의 인큐베이션으로 충분한 효과를 얻는 경우가 있습니다. (실온, 교반). 스킴밀크 (Skimmed Milk) 를 블로킹제로 사용하는 경우도 마찬가지입니다. 또한, ECL Advance 를 사용하는 경우에는 블로킹제의 변경이나 블로킹 시간의 단축은 추천하지 않습니다.
힌트② 막의 블로킹
90 초단축블로킹 후에 막의 워시시간을 단축시키는 것이 가능합니다. 이 경우, PBS-T 또는 TBS-T 안에서 15 초 동안 블랏을 헹구고, 그 후에 버퍼를 교환하여 한번 더 15 초 동안 헹구어 주십시오.
40 분단축1 차항체 농도를 높이는 것으로 감도를 낮추지 않고 1 차항체 반응 시간 을 20 분 정도까지 단축 할 수 있습니다 . 반응 시간에 맞추어 항체의 농도를 재검토 하십시오.
5 분단축1 차항체의 워시는 가능한 많은 양의 워시 버퍼 (PBS-T 또는 TBS-T) 를 이용하여, 3 회 이상 블랏을 린스 한 뒤, 실온에서 10 분동안 워시하십시오.
샘플에 따라서항체에 따라서는 37℃에서 반응 하면 시간 단축이 가능한 경우가 있습 니다 .
힌트③ 2 차항체의 반응
45 분단축2 차항체 농도를 높이는 것으로 , 감도를 낮추지 않고 시간단축이 가능합 니다. 일반적으로, 4 배 농도로 15 분간 인큐베이션 (실온, 교반) 하면 동등한 결과를 얻을 수 있습니다. 이 경우, 백그라운드를 억제하기 위해서 막의 워시는 충분히 수행하십시오.
5 분단축1 차항체의 워시와 마찬가지로, 가능한 많은 양이 워시 버퍼 (PBS-T 또 는 TBS-T) 를 이용하여, 3 회 이상 블랏을 린스한 뒤, 실온에서 10 분 워시하십시오.
힌트④ 검출
샘플에 따라서1 차항체 및 2 차항체 농도를 높이는 것으로 노출시간을 단축 할 수 있습니다.
30 분단축ImageQuant LAS 4000 시리즈와 같은 CCD 이미저를 사용하면, 현상시간이 생략되므로, x 선 필름에 의한 검출에 비해서 시간을 큰 폭으로 단축 할 수 있습니다 .
ECL Trouble Shooting
밴드가 검출되지 않는 경우
시그날이 검출되지 않는 경우전체적으로 검은색으로, 밴드가 검출되지 않는 경우밴드는 있지만 일부가 검출되지 않는 경우
ECL1ECL2
ECL3
밴드는 검출되지만 결과가 만족스럽지 않은 경우
시그날이 약함시그날이 지나치게 강함시그날이 하얗게 흐려짐비특이의 밴드가 검출됨
ECL4ECL5ECL6
ECL7
밴드 이외에 문제가 있는 경우
불규칙적인 얼룩이 생김백그라운드가 높음그외의 이물질이나 비특이적인 검출
ECL8ECL9
ECL10
Solution
밴드가 검출되지 않는 경우

ECL3-1
밴드는 있지만 일부가 검출되지 않는 경우

 

스텝
원인
해결책
블로팅젤과 막 사이에 기포가 들어감기포가 들어가지 않도록 확인
젤에 막을 겹칠 때에 , 젤과 막이 확실히 밀착되어 있는지 확인하십시오 . 기포가 섞여 들어갈 경우에 젤 막 표면상을 워시 살균한 피펫이나 막대를 굴려서 기포를 제거합니다 .
밴드는 검출되지만 결과가 만족스럽지 않은 경우

ECL6-1
시그날이 하얗게 흐려짐

 

스텝
원인
해결책
샘플조제 · 전기영동표적 단백질의 양이 너무 많음샘플 첨가량을 줄임
젤이나 막을 염색해서 표적 단백질의 양을 확인한 후, 검출에 충분한 양의 표적 단백질이 포함되어 있도록 샘플 첨가량을 조정합니다.
항체반응항체농도가 너무 높음항체농도의 검토
검출에 적합한 항체농도를 닷블랏 법으로 검토합니다.
검출검출 전에 루미놀이 급속하게 소비되고 있음노출시간을 짧게 함
화학발광의 경우 노출시간을 길게 합니다.
밴드가 검출되지 않는 경우

ECL3-1
밴드는 있지만 일부가 검출되지 않는 경우

 

스텝
원인
해결책
블로팅∼항체반응막에 지문이나 케라틴 등 불순물이 흡착되어 있음장갑이나 핀셋을 사용
막을 직접 만지지 않도록, 장갑을 끼거나 끝이 평평한 (막에 상처가 생기지 않도록 하기 위해) 핀셋을 사용합니다.
블로팅막의 친수처리가 불충분새로운 막을 사용
새로운 막으로 친수화 처리를 수행합니다. 친수화가 균일하게 처리되도록 확인합니다.
막이 버퍼상에 뜨지 않도록 확인
친수화가 불충분하면 막이 수면에 뜨게 되므로, 버퍼에 충분히 담궈지지 못합니다. 끝이 평평한 핀셋 등으로 막을 가라앉혀서 버퍼에 잘 담급니다 .
항체반응이차항체가 응집되어 있음2 차 항체를 필터로 여과 함
응집한 2 차 항체가 막에 흡착되면, 반점상의 얼룩으로 검출됩니다. 2 차항체를 φ 0.2 μm 필터로 여과하거나 가볍게 원심한 후 상층액을 회수하여 응집체를 제거해 냅니다.
검출검출시약의 제거가 불충분여분의 검출시약을 제거함
막상의 과잉의 검출시약을 제거하고 검출한다.

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