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Operation

Operation

Column Operation에서는 Column Packing에 대한 소개 및 유지보수에 대한 내용을 확인하실 수 있습니다.

XK Column Packing (video)

 

Column packing의 원리, 실제 packing 비디오, 설명, packing evaluation까지 전 과정을 강의와 동영상으로 배울 수 있습니다.  Column의 기본이면서 가장 많이 사용하는 XK column을 사용해서 제작하였습니다.

아래 XK instruction을 참고하시기 바랍니다.

 

Column Packing

Preparation & Maintenance

컬럼팩킹 방법은 사용하고자 하는 컬럼의 타입에 따라서 아래의 그림과  같이 크게

  1. Pressure/Flow packing,
  2. Mechanical Compression packing,
  3. Pack-in-Place packing

으로 3가지로 나뉘어집니다.

Column_packing

첫번째로, Pressure/Flow packing 방법은 컬럼에 50~60%로 희석된 균질한 레진의 슬러리를 부워준 다음 아답터를 장착한 뒤, 공기가 들어가지 않도록 주의하여 아답터와 Net을 통해 팩킹용액을 레진의 특성에 따라 적절한 압력과 유속을 주어 가라앉거나 압착한 뒤 아답터를 내려서 충진하는 방법입니다. 가장 많이 사용되지만 일반적으로 빠른 유속이 필요하며 많은 양의 팩킹 용액이 소모됩니다. 대부분의 Lab column들과 GE의 BPG 컬럼이 해당 방식으로 운용됩니다.
이에 대한 부분은 Column>Model 에서 대표적인 컬럼들의 팩킹 방법을 확인해보실 수 있습니다.

 

 두번째로, Mechanical Compression 방법은 첫번째 방법과 마찬가지로 균질하게 희석된 레진을 컬럼에 부워준 다음 아답터를 장착한 뒤, 아답터의 위쪽 부분에 물을 채워 수압을 이용하거나 전동모터를 사용하여 아답터의 축 자체를 수직으로 내려주는 방법입니다. Pilot scale 또는 Process scale에서 사용되며 IndEx, Axichrom, Fineline 등의 컬럼이 해당 방식으로 운용됩니다.

 

 마지막으로, Pack-in-Place 방식은 Process scale에서 선호되는 방식으로 컬럼이 커지는 경우 직접 슬러리를 넣어주거나 아답터 자체를 움직이는 방식은 안전상의 문제로 어렵기 때문에 컬럼에서 아답터의 높이를 미리 고정시켜 놓은 뒤, 공기압을 이용하여 따로 마련된 펌프와 컬럼의 상/하단부에 장착된 노즐의 Packing/Unpacking/Run 모드를 이용해, 컬럼 내부에 레진을 분사하여 팩킹을 진행을 하는 방식으로 Chromaflow라는 컬럼이 해당 방식으로 운용이 됩니다.

Column Packing

Preparation & Maintenance

Sample Preaparation

시료 조제

크로마토그래피 정제를 위한 시료는 깨끗하고 입자상 물질(미세 먼지)가 없어야 합니다. 정제를 시작하기 전에 시료를 정화하는 간단한 단계로 컬럼이 막히는 것을 피할 수 있으며, 엄밀한 세척 과정의 필요성을 줄일 수 있습니다. 또한 크로마토그래피 매질의 수명을 연장시킬 수 있습니다.

 

시료 정화

원심 분리와 여과는 시료 정화를 위한 표준적인 실험 방법이며, 작은 시료를 다룰 때 일상적으로 사용됩니다. 어떤 시료든지 크로마토그래피 정제 바로 직전에 원심분리와 여과를 시행할 것을 강력히 추천합니다.

 

원심분리

원심분리는 세포 잔사와 같은 지질과 입자상 물질(미세먼지)을 제거합니다. 만일 원심분리 후에도 여전히 시료가 깨끗하지 않다면 여과지 혹은 5㎛ 여과기를 먼저 사용한 뒤, 그 보다 pore사이즈가 작은 여과기를 사용하도록 합니다.

  • 시료 부피가 작거나 필터에 흡착되는 단백질의 경우 10,000 g에서 15분 동안 원심분리시킵니다.
  • 세포 파쇄물의 경우 40,000~50,000 g에서 30분 동안 원심분리시킵니다.
  • 혈청 시료는 남아 있는 지질을 제거하기 위해 원심분리 후에 유리 섬유(glass wool)를 이용하여 여과시킬 수 있습니다.

 

여과

여과는 입자상 물질을 제거합니다. 비특이적 결합을 하는 단백질을 최소한으로 남기는 막여과기는 cellulose acetate 혹은 PVDF로 구성됩니다.
크로마토그래피 전에 시료 조제를 위해 크로마토그래피 매질의 담체 크기와 비교하여 여과기 기공의 크기를 선택합니다.
시험 공정 중 표적 단백질 회수를 확인합니다. 일부 단백질은 여과기 표면에 비특이적으로 흡착될 수 있습니다.

 

탈염

탈염 컬럼은 시료의 양에 상관없이 적합하며, 단 한 과정으로 분자량이 낮은 오염물질을 빠르게 제거하는 동시에 시료를 올바른 완충액 환경으로 이동시킵니다. 여기서도 탈염 전 시료 원심 분리와/ 혹은 여과가 추천됩니다.
실험실 규모에서 여과 혹은 원심 분리 후 시료가 적정하게 깨끗할 경우 완충액 교환과 탈염 단계를 건너 뛸 수 있습니다. 친화 크로마토그래피 혹은 소수성 상호반응 크로마토그래피에서 시료의 pH를 조정하는 것으로 충분할 수 있으며, 필요하다면 이온 강도가 감소된 용액으로 희석시킵니다.

⇒ 시료의 양이 많든 적든 빠르게 공정을 수행합니다. 필요하다면 정제 단계 전과 정제 단계 사이에 모두 혹은 정제 전이나 정제 단계 사이에 사용하십시오(각각의 추가 단계는 결과물을 감소시킬 수 있으며, 또한 탈염은 시료를 희석시킨다는 것을 기억하십시오).
⇒ 상대분자량이 5000보다 큰 단백질로부터 염을 제거합니다.
⇒ 만일 휘발성 완충액이 필요하다면 100mM 아세트산암모늄 혹은 100mM 탄산수소암모늄을 사용합니다.

 

특이 시료 조제 단계

조시료(curde sapmple) 내에 컬럼에 축적될 수 있는 지질 혹은 페놀레드와 같은 오염물질을 포함되어 있거나 bulk 단백질과 같은 어느 정도 큰 불순물을 크로마토그래피 단계 전에 제거해야 한다면 특이 시료 조제 단계가 필요할 수도 있습니다.

 

황산암모늄 침전법

일부 단백질은 황산암모늄에 의해 손상될 수 있습니다. 국소적으로 농도가 높아지면 원하지 않는 단백질이 포함된 침전물로 오염될 수 있으므로 황산암모늄 결정을 첨가할 때는 조심해야 합니다. 통상적으로 크로마토그래피를 위해서 재정제와 황산 암모늄 침전법은 피해야 합니다.
일반적으로 침전법은 1 ㎎/㎖보다 낮은 단백질 농도에서는 효과가 거의 없습니다.

침전을 위해 필요한 용액 :

  • 포화된 황산암모늄 용액 (100㎖의 증류수에 100g의 황산암모늄을 넣고 저어서 용해시킵니다).
  • 1M Tris-HCl, pH 8.0 (첫 번째 정제 단계를 위한 완충액)

 

단백질 침전물의 재용해

많은 단백질이 다음 크로마토그래피 단계에 쓰일 적은 양의 완충액에 쉽게 재용해됩니다. 하지만, 단백질이 덜 용해되도록 하기 위해 변성 약제가 필요할 수도 있습니다.
특이성 조건은 특이성 단백질에 달려 있습니다. 단백질이 완전히 다시 접히도록 하며(refolding), 질량과 활성의 회복을 최대화하기 위해 이러한 약제는 항상 제거해야 합니다. 정제 시 종종 크로마토그래피 단계에서 변성제가 제거됩니다.

 

완충액 교환과 탈염

투석은 염이나 작은 분자를 제거하고 시료 완충액 조성을 교환하기 위한 방법으로 문헌에서 자주 언급됩니다. 하지만, 투석은 일반적으로 많은 양의 완충액을 필요로 하는 매우 느린 방법입니다.
조작하는 동안 혹은 단백 분해 붕괴 혹은 투석막에 대한 비특이적 결합의 결과로 재료를 손실할 위험이 있습니다. 더 간단하고 훨씬 빠른 방법은 Sephadex G-25로 충전된 탈염 컬럼을 이용하여 분자량이 높고 낮은 물질 간의 집단 분리를 수행하는 것입니다. 단백질은 염과 다른 작은 분자들로부터 분리됩니다.
단일의 빠른 과정으로 시료를 탈염시키고, 새로운 완충액으로 이동시키며 분자량이 낮은 물질을 제거합니다.
탈염 컬럼은 염과 같은 분자량이 낮은 오염물을 제거할 뿐만 아니라 다른 크로마토그래피 과정 전이나 후의 완충액 교환과 반응을 종결시키는 시약을 빠르게 제거하기 위해 사용됩니다.
공정이 가능한 시료의 양은 탈염 컬럼 총 부피의 30%까지입니다.
일반적인 수용성 완충액을 이용할 때 단백질의 농도가 70㎎/㎖를 넘지 않는 한 시료 농도는 분리에 영향을 주지 않습니다. 시료는 완전히 용해되어야 합니다. 입자상 물질(미세 먼지)을 제거하기 위해 원심 분리 혹은 여과를 시행합니다.
시료의 양이 적은 경우 크로마토그래피 정제에 사용될 출발완충액(start buffer)에 시료를 희석하는 것이 가능할 수 있으나 세포 잔사와 입자상 물질은 제거되어야 합니다.
혹시 일어날 수 있는 이온 상호반응을 막기 위해 탈염을 할 때 최종 시료 완충액에 낮은 염농도(25 mM NaCl)를 노출시키는 것이 추천됩니다.
NaCl 노출을 피해야 한다면 100 mM 아세트산암모늄 혹은 100 mM 탄산수소암모늄과 같은 휘발성 완충액을 사용할 수 있습니다.

 

양이 많은 시료를 탈염하려면:

  • 시료 부피 용량을 증가시키기 위해 5 HiTrap Desalting 5㎖ 컬럼을 연속적으로 연결하여 사용합니다. 예를 들면, 컬럼 2: 시료 부피 3㎖, 5 컬럼 : 시료 부피 7.5㎖.
  • 시료 부피 용량을 증가시키기 위해 4 HiPrep 26/10 Desalting 컬럼을 연속적으로 연결하여 사용합니다. 예를 들면, 2 컬럼: 시료 부피 30 ㎖, 4 컬럼: 시료 부피 60㎖.

4개의 컬럼을 연속적으로 사용하더라도 실온에서 수용성 완충액을 이용하여 20~30분이면 시료 공정을 마칠 수 있습니다.
각 컬럼마다 설명서가 제공됩니다. 대부분의 단백질의 경우 95% 이상 회수되는 동시에 탈염과 완충액 교환은 시료 당 5분이 채 걸리지 않을 수 있습니다.

 

지질단백질의 제거

지질단백질과 다른 지질은 크로마토그래피 컬럼을 급속히 막을 수 있으므로 정제를 시작하기 전에 이들을 제거하는 것이 좋습니다. 시료로부터 고농도의 지질단백질을 제거하기 위해 분획 침전 시 사용되는 dextran sulphate와 polyvinylpyrrolidine과 같은 침전 약제들이 추천됩니다. 표적 분자가 여과기에 비특이적으로 결합하는 위험을 피하기 위해 시료를 원심분리시킵니다. 혈청과 같은 시료는 남아 있는 지질을 제거하기 위해 유리섬유(glass wool)를 이용하여 여과시킬 수 있습니다.

페놀레드의 제거

페놀레드는 실험실에서 세포 배양 시 pH 지시약으로 자주 사용됩니다. 정제를 직접적으로 방해하지 않는다고 해도 페놀레드는 특정 정제 매질에 결합할 수 있으며, 오염되지 않도록 가능한 한 조기에 제거해야 합니다. pH>7에서 음이온 교환 매질에 결합하는 것으로 알려져 있습니다.
완충액 교환과 탈염 부분에서 설명된 것처럼 페놀레드(분자량이 낮은 분자)를 제거하는 동시에 다음 정제를 위한 정확한 완충액 조건으로 시료를 이동시키기 위해 탈염 컬럼을 사용하십시오.

 

분자량이 낮은 오염물질의 제거

완충액 교환과 탈염 부분에서 설명한 것처럼 만일 시료에 분자량이 낮은 오염물질이 다량 포함되어있다면 첫 번째 크로마토그래피 정제 단계 전에 탈염 컬럼을 이용하십시오.

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