워크샵 신청하기

Theory

Theory

ÄKTA 시스템을 사용하기 위해서는 크로마토그래피의 기본에 대한 이해가 필요합니다.

 

기본적으로 “크로마토그래피란 무엇인가?”에서부터 단백질 정제를 위해 사용되는 액체크로마토그래피의 기법 (젤여과, 친화, 이온교환, 소수성, 역상크로마토그래피)에 대한 이론을 공부할 수 있습니다.

chromatograph_main_image

Chrom.란?

Gel Filtration

Ion Exchange

HIC

Affinity

RPC

Chromatography란?

단백질 정제를 위한 액체크로마토그래피

chrom_1

크로마토그래피는 1906년 러시아의 식물학자에 의해 식물색소의 분리를 위해 고안된 이후, 분리분석의 수단으로서 가장 널리 자주 사용되고 있는 방법입니다. 이는 이동상과 고정상 사이에서 혼합물에서의 각각의 물질 특성에 따른 이동속도의 차이를 기반으로 혼합물을 분리하는 기법입니다. 이 중에서도 액체크로마토그래피는 이동상이 액체인 것을 이야기하며, 시료를 적당한 전개제로 이동시켜 시료의 성분들이 고정상에 대한 흡착성이나 분배계수의 차이에 따른 이동속도의 차를 이용하여 분리하여 이를 차동굴절계 또는 자외광도계를 통해 검출하는 방법으로 무기이온, 아미노산, 단백질 등의 정제나 정량에 유용한 방법입니다. 이러한 액체크로마토그래피는 시료의 특성에 따라 고정상에 물질이 흡착/탈착이 되는 성질을 이용하거나 단순히 시료의 크기에 따라 다공성 고정상을 통과하는 분배계수의 차를 이용하는 것으로 크게 나눌 수 있으며, 이를 이온교환 (Ion Exchange, IEX), 친화 (Affinity, AF), 소수성 크로마토그래피(Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC)와 크기배제크로마토그래피 (Size Exclusion Chromatography, SEC 또는 겔여과(Gel Filtration, GF))로 특성에 따라 분류를 하고 있습니다.

단백질은 생체구성 및 호르몬 등과 같은 기능성 물질의 주요 성분으로 생명활동에서중요한 역할을 하는 고분자로 다양한 아미노산이 연결되어 3차구조를 이루고 있습니다. 자체적으로도 선형/구형의 구조 또는 다양한 크기와 같은 물리적인 성질과 아미노산의 배열이나 구조, 그리고 주변의 산도나 전도도에 따라서 양 또는 음전하를 지니는 정전기적 인력, 물을 싫어하는 소수성, 그리고 특정 금속 또는 항원 항체 등과 같이 선택적 반응을 하는 친화적인 성질과 같은 생물/화학적 성질을 지니게 됩니다. 이러한 액체크로마토그래피는 단백질의 안정성을 변화시킬 수 있는 열이나 마찰력 등에 상당히 안정적이기 때문에 단백질의 정제를 위해 많이 사용이 되고 있습니다. 자세한 설명은 각각의 기법에 대한 탭을 참조하십시오.

chrom_2
chrom_3

Chrom.란?

Gel Filtration

Ion Exchange

HIC

Affinity

RPC

Gel Filtration (GF)

높은 용리 (Superdex™ 이용)
겔 여과는 분자 크기의 차이에 따라 단백질을 분리합니다. 이 방법은 시료의 양이 최소화될 때 사용해야 합니다. 완충액 조성이 용리에 직접적인 영향을 주지 않으므로 시료의 형태 혹은 다음 정제, 분석, 혹은 보관 단계를 위한 요구 조건을 맞추기 위해 완충액 조건을 변화시킬 수 있습니다. 분리의 주요 단계가 그림 5에 나와 있습니다.

akta_theory_gf

시료의 양과 용량
가장 높은 용리를 얻기 위해 시료의 양은 총 컬럼 부피의 5%를 넘지 않아야 합니다. 겔 여과는 시료의 농도와 관계가 없습니다.

 

매질과 컬럼의 선택
Gel Filtration Selection Guide(Code: 18-1124-19)를 참고하십시오. 겔 여과에서 효율적인 컬럼 충전은 필수적입니다. 재현 가능한 결과와 효율적인 수행을 위해 미리 충전된 컬럼을 사용하도록 합니다.

 

시료 조제
시료 내에 입자상 물질(미세 먼지)이 없어야 합니다. 점성이 있는 시료는 희석해야 합니다. 분리하는 동안 시료 완충액은 컬럼 내 완충액으로 교환됩니다.

 

완충액 조제
정제된 산물이 회수될 완충액을 선택합니다. 완충액은 단백질 안정성과 활성에 적합해야 합니다. 이온 강도는 매트릭스와의 비특이성 이온 상호작용을 막기 위해 150 mM까지 사용할 수 있습니다. 새로운 시료로 작업할 때 다음과 같은 조건을 먼저 시도해봅니다.

 

집단 분리
Sephadex™ G-25는 시료 조제와 정화를 위해 탈염, 완충액 교환, 그리고 지질을 제거하는 데에 사용하고, Mr이 5000을 초과하는 단백질부터는 염을 이용합니다. 또한 겔 여과는 정제 단계 전이나 사이의 시료 조제에 이상적입니다. 총 컬럼 부피의 30%까지 시료를 주입합니다. 단 한 개의 과정으로 시료를 탈염하고 새로운 완충액으로 교환하며, 분자량이 낮은 물질을 제거합니다.
시료의 양이 많든 적든 빠르고 효율적으로 처리할 수 있습니다. 많은 양의 시료를 주입하면 용리 분리가 낮으나 시료가 최소한으로 희석됩니다.

Chrom.란?

Gel Filtration

Ion Exchange

HIC

Affinity

RPC

Ion Exchange Chromatography (IEX)

높은 용리 – 고용량
IEX는 단백질 표면의 순전하 차이에 기초하여 단백질을 분리합니다. 전하를 띤 단백질과 반대의 전하를 가진 크로마토그래피 매질 간의 가역적인 상호작용을 기초로 분리합니다.

컬럼 내에 단백질을 주입하면 단백질이 결합됩니다. 그 후 조건이 변화되면 결합된 물질들이 차별적으로 용출됩니다. 이러한 용출은 보통 염농도의 증가나 pH 변화에 의해 이루어집니다. 가장 일반적으로 그림 1에서처럼 구배용출법을 이용하여 염(NaCl)으로 시료를 용출시킵니다. 표적 단백질은 결합하는 동안 농축되며 정제되고 농축된 형태로 회수됩니다.

IEX

이온 교환기의 선택

강한 교환기부터 사용하여, 방법을 고안하는 동안 넓은 범위의 pH에 걸쳐 실험할 수 있도록 합니다.

 

강한 이온 교환기

Q(음이온 교환기), SP(양이온 교환기): 넓은 pH 범위(pH 2~12)에 대해 충분한 전하를 띰.

 

약한 이온 교환기

DEAE와 ANX(음이온 교환기), CM(양이온 교환기): 좁은 pH 범위(각각 pH 2~9, pH 6~10)에 대해 충분한 전하를 띠나 분리에 있어서 대체가능한 선택성을 부여합니다.

 

시료의 양와 용량

구배용출법을 이용한 최적의 분리를 위해 총 결합용량의 약 1/5 정도를 사용합니다. IEX는 시료의 양에 구애받지 않는 결합 방법입니다.

 

매질과 컬럼의 선택

Ion Exchange Selection Guide Code no: 18-1127-31을 참고하십시오. 적절한 매질을 찾고 실험 방법을 최적화하기 위해 HiTrap™ IEX Selection Kit를 이용하십시오.

 

시료 조제

시료는 출발 완충액(starting buffer)과 같은 pH, 이온 강도를 가져야 하며, 입자상 물질(미세 먼지)이 없어야 합니다.

 

완충액 조제

만일 전하 특성을 모른다면 다음과 같은 조건을 먼저 시도해봅니다.

  • Anion Exchange
Start buffer (A) : 20mM Tris-HCl, pH 7.4
Elution buffer (B) : 20mM Tris-HCl + 1M NaCl, pH 7.4
Gradient : 0-100% elution buffer in 10-20 column volumes

 

  • Cation Exchange
Start buffer (A) : 20mM Na₂HPO₄ X 2H₂O, pH 6.8
Elution buffer (B) : 20mM Na₂HPO₄ X 2H₂O + 1M NaCl, pH 6.8
Gradient : 0-100%B in 10-20 column volumes

Chrom.란?

Gel Filtration

Ion Exchange

HIC

Affinity

RPC

Hydrophobic Interaction Chromatography (HIC)

양호한 용리 – 양호한 용량

HIC는 단백질의 소수성 차이에 따라 단백질을 분리합니다. 이러한 분리는 단백질과 크로마토그래피 매질의 소수성 표면 간의 가역적인 상호작용에 기초합니다. 이 상호작용은 높은 이온 강도를 가진 완충액에 의해 향상되며, 그로 인해 HIC는 황산암모늄으로 침전되었거나 IEX로 고염에 용출된 단백질 정제를 위한 이상적인 ‘다음 단계’가 됩니다.
이온 강도가 높은 용액(예를 들면, 1.5 M NH2SO4) 내의 시료는 컬럼 내로 주입되자마자 결합하게 됩니다. 그 후 조건은 변화되어 결합된 물질은 차별적으로 용출됩니다. 용출은 주로 염 농도 감소에 의해 이루어집니다. 그림 3과 같이 가장 일반적으로 황산암모늄의 감소 구배로 샘플을 용출시킵니다. 표적 단백질은 결합되는 동안 농축되며, 정제되고 농축된 형태로 회수됩니다. 다른 용리 과정도 이용 가능합니다.

HIC

소수성 리간드의 선택
다양한 리간드 중에서 선택합니다. 일반적으로 ether, isopropyl, butyl, octyl, phenyl의 순으로 단백질에 대한 리간드의 결합 강도가 증가합니다. 소수성이 큰 단백질은 높은 소수성의 리간드에 단단히 결합하게 됩니다.
몇 가지 소수성 매질을 검사해보도록 합니다. 만일 시료가 소수성이 큰 성분을 가진다면 낮은 소수성의 매질부터 시작합니다. 낮은 염농도에서 가장 양호한 용리와 로딩 용량을 부여하는 매질을 선택합니다.

 

시료의 양과 용량
구배용출 시 최적의 분리를 위해 컬럼의 총 결합 용량의 약 1/5 정도를 사용합니다. HIC는 시료의 양에 구애받지 않는 결합 방법입니다.

 

매질과 컬럼의 선택
HIC를 이용할 때 소수성 리간드 뿐 아니라 크로마토그래피 매질도 선택성에 영향을 줍니다.
요구되는 규모에서의 시료 용해도, 정제의 규모, 올바른 리간드의 유용성과 같은 지표들을 고려해야 합니다. 적절한 매질을 찾고 실험 방법을 최적화하기 위해 HiTrap HIC Selection Kit나 RESOURCE™ HIC Test Kit를 사용합니다.

 

시료 조제
시료는 출발 완충액(starting buffer)과 같은 pH를 가져야 하며, 이온 강도가 높은 용액 내에 있어야 한다. 또한 입자상 물질(미세 먼지)이 없어야 합니다.

 

완충액 조제
만일 소수성 특성이 알려져 있지 않다면, 다음의 조건을 먼저 시도해봅니다.

 

Start buffer (A) : 50mM Na₂HPO₄ X 2H₂O pH 7,0 + 1.0M ammonium sulphate
Elution buffer (B) : 50mM Na₂HPO₄ X 2H₂O pH 7,0
Gradient : 0-100% in 10-20 column volumes

Chrom.란?

Gel Filtration

Ion Exchange

HIC

Affinity

RPC

Affinity Chromatography (AC)

높은 용리 – 높은 용량

AC는 단백질(혹은 단백질 집단)과 크로마토그래피 매트릭스에 부착된 특이 리간드 간의 가역적인 상호작용을 기초로 하여 단백질을 분리합니다. 적합한 리간드가 사용 가능하다면 언제든지 AC를 이용할 수 있습니다.

표적 단백질은 상보적 결합 물질(리간드)에 특이적, 가역적으로 부착합니다. 시료는 특이적 결합이 잘 일어나는 조건 하에 적용됩니다. 결합되지 않은 물질은 씻겨 내려가고 결합된 표적 단백질은 탈착이 잘 일어나는 조건으로 바꾸어 줌으로써 회수됩니다. 탈착은 경쟁적 리간드를 이용하여 특이적으로 이루어지거나 pH, 이온 강도 혹은 극성을 변화시켜 비특이적으로 탈착이 일어나게 합니다. 결합하는 동안 농축된 단백질은 정제되고 농축된 형태로 회수됩니다. 분리의 주요 단계들이 그림 4에 나와 있습니다.

[그림4]affinity

시료의 양과 용량
총 결합 용량(결합된 표적 단백질/㎖ 매질)은 상업적으로 유용한 친화성 매질에 한정됩니다. AC는 시료의 양에 구애받지 않는 결합 방법입니다.

 

매질과 컬럼의 선택
친화성 매트릭스의 상업적 유용성을 고려해야 합니다. 바로 사용할 수 있는 친화성 매질을 적용한 예들이 표 1에 나와 있습니다. 특이적 친화성 매질은 추천되는 결합(coupling) 과정에 따라 선택된 겔 매트릭스에 리간드를 결합시켜 만들어집니다. 매질에 대한 보다 자세한 사항은 Affinity Chromatography Selection Guide(Code No. 18-1121-86)Prepacked chromatography columns for ÄKTA™ systems에 나와 있습니다. 실험 방법을 최적화 하거나 규모가 작은 정제를 위해 미리 충전된 HiTrap Affinity 컬럼을 이용하십시오.

 

시료 조제
시료는 비특이적으로 컬럼에 결합할 수 있는 입자상 물질(미세 먼지)과 오염물질이 없어야 합니다.

 

완충액 조제
결합, 용출 그리고 재생 완충액은 각각의 친화성 매질마다 다릅니다. 제공된 설명서를 따르도록 합니다.

Chrom.란?

Gel Filtration

Ion Exchange

HIC

Affinity

RPC

Reversed Phase Chromatography (RPC)

높은 용리
RPC는 분자와 크로마토그래피 매질의 소수성 표면 간의 가역적인 상호작용에 기초하여 소수성이 서로 다른 분자를 분리합니다. 시료는 컬럼 내로 주입되면서 결합합니다. 그 후 조건은 결합된 물질이 차별적으로 용출되도록 변화됩니다. 역상 매트릭스의 특성 상 흔히 아주 강하게 결합하며, 용출을 위해 유기 용매와 다른 첨가제(이온 결합제)의 사용이 필요합니다. 용출은 대개 유기 용매의 농도 증가로 이루어지며, 아세토나이트릴이 가장 흔하게 사용됩니다. 결합 과정에서 농축된 분자는 정제되고 농축된 형태로 회수됩니다. 분리의 주요 단계가 그림 6에 나와 있습니다.
RPC는 올리고뉴클레오타이드와 펩티드의 최종 연마에서 종종 사용되며 펩티드 지도작성과 같은 분석적인 분리에 이상적입니다.
많은 단백질이 유기 용매에 노출되면 변성되기 때문에 만일 활성 회복과 정확한 3차 구조로의 복귀가 요구된다면 RPC는 단백질 정제에 추천되지 않습니다.

rpc

리간드 소수성의 선택
요구되는 소수성 정도에 따라 중합체나 실리카 기반 매트릭스인 C4, C8 아니면 C18 n-alkyl hydrocarbon 리간드를 선택합니다. 소수성이 큰 분자는 소수성이 큰 리간드(예를 들면 C18)에 단단히 결합합니다. 여러 RPC 매질을 탐색해봅니다. 시료가 소수성이 큰 성분(생체 분자 같은 경우)을 가진다면 소수성이 낮은 매질(예를 들면 C4 혹은 C8)부터 시작합니다. 최고의 용리와 주입 용량을 제공하는 매질을 선택합니다.

 

시료의 양과 용량
RPC는 시료의 양에 구애받지 않는 결합 방법입니다. 총 용량은 실험 조건과 매질, 시료의 성질에 많이 의존합니다. 구배용출 시 최적의 환경을 위해 용리를 감소시키지 않는 시료 주입량을 찾도록 합니다.

 

매질과 컬럼의 선택
RPC에서 소수성 리간드 뿐 아니라 크로마토그래피 매질 또한 선택성에 영향을 미칩니다. 서로 다른 RPC 매질에 대한 선별이 추천됩니다. 역상 컬럼은 처음 사용할 때, 장기간 보관 후에 혹은 완충액 시스템을 바꿀 때에 평형을 연장시킴으로써 ‘condition’시켜야 합니다.

 

시료 조제
시료에 입자상 물질(미세 먼지)이 없어야 하며, 가능하면 출발 완충액(start buffer)에 용해시켜야 합니다. 시료가 불용성이라면 1) 10-30% acetic acid, 2) 70% formic acid, 3) 6 M guanidine-HCl, 4) 100% DMSO (dimethyl sulphoxide), 5) TFA (trifluoroacetic acid)를 시도해봅니다. DMSO에 용해된 소수성이 큰 펩티드는 침전하거나 RPC 매트릭스에 비가역적으로 결합할 수 있다는 것을 주의합니다. 먼저 시료의 부분 표본으로 시험해봅니다.

학술 문의

카카오톡 플러스친구 @지이헬스케어라이프사이언스 (1:1 실시간 문의)
E-mail : ts.kr@ge.com

견적 / 가격 문의

카카오톡 플러스친구 @지이헬스케어라이프사이언스 (1:1 실시간 문의)
02-6201-3800 (#3)
E-mail : Is.kr@ge.com

서비스 문의

카카오톡 플러스친구 @지이헬스케어라이프사이언스 (1:1 실시간 문의)
02-6201-3800 (#1)
E-mail : Is.service@ge.com

PGlmcmFtZSB3aWR0aD0iMTAwJSIgaGVpZ2h0PSIxMDAlIiBzcmM9Imh0dHBzOi8vd3d3LnlvdXR1YmUuY29tL2VtYmVkL2JydlJMOXFGQUNJIiBmcmFtZWJvcmRlcj0iMCIgYWxsb3dmdWxsc2NyZWVuPjwvaWZyYW1lPj9yZWw9MCIgZnJhbWVib3JkZXI9IjAiIGFsbG93ZnVsbHNjcmVlbj48L2lmcmFtZT4=
PGlmcmFtZSB3aWR0aD0iMTAwJSIgaGVpZ2h0PSIxMDAlIiBzcmM9Imh0dHBzOi8vd3d3LnlvdXR1YmUuY29tL2VtYmVkL1JucjlKcXd2WHlNIiBmcmFtZWJvcmRlcj0iMCIgYWxsb3dmdWxsc2NyZWVuPjwvaWZyYW1lPj9yZWw9MCIgZnJhbWVib3JkZXI9IjAiIGFsbG93ZnVsbHNjcmVlbj48L2lmcmFtZT4=
PGlmcmFtZSB3aWR0aD0iMTAwJSIgaGVpZ2h0PSIxMDAlIiBzcmM9Imh0dHBzOi8vcGxheWVyLnZpbWVvLmNvbS92aWRlby8xNTAzMTY4NTI/Y29sb3I9ZmZmZmZmJnRpdGxlPTAmYnlsaW5lPTAmcG9ydHJhaXQ9MCZiYWRnZT0wIiBmcmFtZWJvcmRlcj0iMCIgYWxsb3dmdWxsc2NyZWVuPjwvaWZyYW1lPg==
PGlmcmFtZSB3aWR0aD0iMTAwJSIgaGVpZ2h0PSIxMDAlIiBzcmM9Imh0dHBzOi8vcGxheWVyLnZpbWVvLmNvbS92aWRlby8xNjk2Mzg4MTc/Y29sb3I9ZmZmZmZmJnRpdGxlPTAmYnlsaW5lPTAmcG9ydHJhaXQ9MCZiYWRnZT0wIiBmcmFtZWJvcmRlcj0iMCIgYWxsb3dmdWxsc2NyZWVuPjwvaWZyYW1lPg==