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2DE Operation에서는 Protocol 및 Video clips를 제공하는 Basic Operation과 더불어, Software 설명, 그리고 실험 중 문제 해결 방법을 제시하는 Trouble shooting을 제공하고 있습니다. 2DE에 관한 모든 것은 이제 GE 실험길라잡이와 함께 하세요.

2DE_ettandalt_6

Basic Operation

Software

TroubleShooting

IEF (Re-Swelling)

Manifold를 이용할 때

(1) Destreak rehydration solution 혹은 rehydration buffer 를 상온에서 녹인다.
Fig1._Destreak_rehydration
Fig. 1) Destreak rehydration

 

(2) 각 IPGstrip길이에 맞게 Destreak rehydration solution을 aliquot하고 (Table 1 참조) aliquot 한 volume대비 0.5% IPG buffer를 첨가 한다. ( ex. Destreak rehydration solution 250ul à 1.25ul IPG buffer 첨가)

스크린샷 2016-07-25 오후 9.00.09스크린샷 2016-07-25 오후 9.00.20Table_1_옆
(3) 가볍게 vortexing 하고 가볍게 spin down
(4) IPGbox를 두껑을 연다.
(5) IPGbox의 Hydrophobic tray에 2) solution를 넣는다.
(6) 원하는 pH range에 IPGstrip을 꺼내고 gel 위에 얇은 film을 (-) 부분부터 제거한다.
(7) Film이 제거된 IPGstrip을 gel 부분이 아래로 향하게 하여, 3)에서 넣은 destreak rehydration solution 이 gel과 닿게 살짝 올려 놓는다. 이때, gel 과 tray 사이에 bubble이 갇히지 않게 한다.
(8) IPGbox의 뚜껑을 닫고 최소 10시간 상온에서 reswelling 을 진행하며, overnight 하기를 권장한다.

 

기존의 Multi-reswelling Tray을 사용할 경우

(1) Reswelling Solution을 위와 동일한 방법으로 준비 한다.
(2) Reswelling Tray을 수평으로 맞추고, IPGbox사용하는 것과 동일한 방법으로 Reswelling Solution을 넣고, Drystrip을 올린다.
(3) Strip 위에 cover fluid oil를 넣는다. 이때 strip이 잠겨서 마르지 않을 정도면 충분
(4) Tray cover를 닫고 최소 10시간 상온에서 reswelling 을 진행하며, overnight 하기를 권장 한다.

multi-reswelling_2Multi-reswelling_1

Multi-tray를 이용한 reswelling도 single tray와 같으며, 다만 그림과 같이 손으로 하는 것이 아니라 포셉을 사용한다.

 

Single Strip holder를 이용할 때

(1) Destreak rehydration solution을 상온에서 녹인다.
(2) 정량을 다 끝낸 protein을 destreak rehydration solution과 섞어서 total sample volume 이 Table 1) 에 있는 각 DryStrip 길이에 맞게 되도록 맞춘다.
→ protein loading 양은 아래의 표 (Table 2)를 참조 하는데 protein 양을 2배로 넣어 준다.
Ex) 18cm pH 3-10 의 경우 coomassie로 할 때 500ug 이 아닌 1mg 을 준비 한다. 그리고Destreak rehydration solution과 섞어서 total sample volume을 340ul 로 맞춘다.
(3) (2)의 total sample volume의 0.5%만큼 IPG buffer를 첨가한다. (ex. Total volume 340ul 일 경우 IPG buffer 1.7ul)
(4) 가볍게 vortexing 하고 가볍게 spin down
(5) IPGbox를 뚜껑을 연다.
(6) IPGbox의 Hydrophobic tray에 2) solution를 넣는다.
(7) 원하는 pH range에 IPGstrip을 꺼내고 gel 위에 얇은 film을 (-) 부분부터 제거한다.
(8) Film이 제거된 IPGstrip을 gel 부분이 아래로 향하게 하여, 3)에서 넣은 destreak rehydration solution 이 gel과 닿게 살짝 올려 놓는다. 이때, gel 과 tray 사이에 bubble이 갇히지 않게 한다.
(9) IPGbox의 뚜껑을 닫고 최소 10시간 상온에서 reswelling 을 진행하며, overnight 하기를 권장 한다.

Iso Electric Focusing

Cup-loading Sample prep.

(1) Destreak rehydration solution을 상온에서 녹인다.
(2) 정량을 다 끝낸 protein을 destreak rehydration solution과 섞어서 total volume 이 100ul ~ 150ul가 되도록 맞춘다. à protein loading 양은 아래의 표 (Table 2)를 참조 하는데 protein 양을 2배로 넣어 준다. Ex) 18cm pH 3-10 의 경우 coomassie로 할 때 500ug 이 아닌 1mg 을 넣는다.
(3) (2)의 total sample volume의 0.5%만큼 IPG buffer를 첨가한다. (ex. Total volume 100ul 일 경우 IPG buffer 0.5ul) 이때 IPGstrip의 pH range에 맞는 IPG buffer를 사용한다.
(4) 가볍게 vortexing 하고 가볍게 spin down

Table_2)_Protem_loading_Vol
Table 2) Protein loading Vol.

 

(2) IPGphor 의 Gold plate 위에 습기나 기타 이물질을 제거하고 manifold를 장착 한다.

 

 

2) IPGphor operation for Manifold and cup-loading

(1) IPGphor 를 30분 전에 미리 켠다.

(2) IPGphor 의 Gold plate 위에 습기나 기타 이물질을 제거하고 manifold를 장착 한다.

이때 물기가 있으면, IEF 진행 중 gold plate가 탈 수 있음
(3) Manifold 위에 resewelling 된 strip을 gel 이 하늘을 향하게 올려 놓는다.
(4) 3DW에 적신 wick paper (electrode pads)를 1개 strip 당 (+)극, (-)극 각 2개씩 gel과 3mm 정도 overlap되게 strip의 gel 위에 놓는다.
(5) Electrode의 백금선을 strip gel과 wick paper가 겹치는 부분에 위치하도록 장착하고 양 옆에 잠금쇠를 잠근다. (+) (-) 두 전극에 같은 방법으로 장착한다.
(6) Sample cup을 strip 위에 insertion kit 을 이용하여 한 번에 장착 한다.
(7) 장착된 cup에 leakage가 생기는지 cup에 coverfluid oil을 넣어서 확인한다.
(8) Leakage를 확인한 후, 준비한 sample을 cup안으로 loading 한다.
pipet tip이 cup과 strip의 gel에 닿지 않도록 수직으로 넣어서 loading 한다.
(9) Cover fluid oil을 manifold 한 lane 당 5.5ml ~ 6ml 정도 부어 strip이 dry 되는 것을 막는다.
(10) IEF program step을 setting 한다.

IEF program step은 sample과 strip길이마다 다양하다.

 

IEF Program Setting example, 13cm, pH 3-10
S1
Step
100 V
1:00 Hrs
S2
step
200 V
1:00 Hrs
S3
Step
300 V
1:00 Hrs
S4
Step
500 V
1:00 Hrs
S5
Grad
1000 V
1:00 Hrs
S6
Grad
8000 V
1:30 Hrs
S7
Step
8000 V
55000 Vhr

 

스크린샷 2016-07-25 오후 9.27.38

 

3) IPGphor operation for Single Stripholder

(1) IPGphor 를 30분 전에 미리 켠다.
(2) IPGphor 의 Gold plate 위에 습기나 기타 이물질을 제거하고 원하는 길이의 Single stripholder를 올려 놓는다.
이때 물기가 있으면, IEF 진행 중 gold plate가 탈 수 있음
(3) Single stripholder 밑에 전극이 Gold plate의 (+)와 (-)에 각각 맞닿게 위치 시킨다.
(4) Sample과 같이 Reswelling 한 Drystrip을 Drystrip의 gel 이 아래로 향하게 하여 Single stripholder의 표면과 닿게 위치시킨다.
(5) cover fluid oil을 strip이 살짝 잠기게 붓고, Single stripholder의 뚜껑을 닫는다. 이때, cover fluid oil이 gold plate에 흥건히 넘쳐 흐르면 안 된다.
(6) IEF program step을 setting 한다. 위의 manifold IEF Program step setting을 참조.

Equilibration

1) Equilibration solution (Table 3)을 상온에서 녹인다.
2) Equilibration solution 10ml 당DTT 100mg 을 녹인다. (A) solution
3) Equilibration solution 10ml 당 Iodoacetamide 250mg 을 녹인다. (B) solution
4) IEF가 끝난 strip을 Equilibration tube 에 gel이 위로 향하고 strip film이 tube 벽 쪽에 향하도록 넣는다.
5) (A) solution 을 Strip에 5ml ~ 10ml 정도 strip gel 표면이 살짝 잠길 정도로 넣고 Rocker 에서 15min 가볍게 shaking 한다.
6) 5)번의 (A) solution을 버리고 (B) solution을 (A) solution과 동일한 양을 넣고 Rocker 에서 15min 가볍게 shaking 한다.
7) Shaking 이 끝나면 solution을 버리고 Equilibration이 끝난 strip을 꺼내서 3DW에 살짝 담가서 washing한다.

 

Table 3) Equilibration Solution

Table3

2D Running For DALT six system

1) Acrylamide Gel making for DALTsix system

(1) DALTsix gel caster body를 바닥에 놓고 body 안에 separator sheet을 한 장 놓는다.
(2) glass plate 1 set을 놓는다.
(3) glass plate 위에 separator sheet를 놓는다.
(4) (2)번 과 (3)을 반복하면서 glass plate 6장을 쌓는다.
(5) 마지막 glass plate 위에 filler sheet를 놓아서 caster body side와 높이가 같게 한다.
(6) caster lid 옆에 sealing rubber에 seal gel을 바르고 아래에 나사를 돌려 조인다.
(7) caster 옆에 black clamp를 채워서 casting 을 완료한다. Cater body 옆을 살펴 보면 홈이 있는데 거기에 Clamp가 맞게 집는다.
(8) casting 된 caster를 세워서 수평을 맞추고 준비한 Acrylamide solution (Table 4)을 caster 뒤쪽에 guide line 홈에 pipe에 천천히 붓는다.
(9) Acrylamide solution이 일정한 높이에 다다르면 정지하고 overlay solution (water saturated butanol or Isopropanol) 을 각 glass plate 마다 같은 양을 넣는다.
(10) Acrylamide 를 굳힌다.

1h 이상 2h 이내로 굳으면 정상이다. 30min 미만으로 굳히면 resolution이 떨어 질 수 있다.

Table 1. Recipes for 12.5 % Homogeneous gel DALT six (1.0mm X 6 gels)

table12.5
Ettan DALT six : 1.0 mm 6장 450ml, 1.5mm 6장 600ml

SE600 Ruby : 2장 100ml

 

2) Sealing Acrylamide gel

(1) Acrylamide gel위에 overlay solution을 버리고 3DW로 남은 overlay solution 을 제거한다.
(2) Equilibration 된 strip을 3DW에 살짝 담갔다 뺀다.
(3) Strip을 gel 위에 올려 놓고, 포셉으로 gel과 strip이 밀착되게 살짝 밀어 넣는다.
(4) Strip위에 녹인 Agarose sealing solution을 붓고 굳힌다.
(5) strip이 sealing된 gel-glass plate를 DALTsix 에 장착한다.
(6) 2-dimension을 running 한다. (초기 gel당 10mA 1h, 나머지 gel 당 40mA running)

positioningIPG
Fig 1. Positioning IPGstrip after equilibration

 

Agarose2Agarose1
Fig 2. Agarose sealing of IPGstrip

 

Second Dimensional Running
Daltsix
Fig 3. DALTsix System

Dalt_twelve
Fig 4. DALTtweleve System

Staining

PlusOne Silver Staining Kit

Prepare staining reagents (250 ml per gel) according to the PlusOne Silver Staining Kit, Protein instructions with the following exceptions:

 

1. Prepare twice the volumn of fixing solution as indicated in the kit instructions (i.e. 500 ml per gel rather than 250 ml).
2. Prepare the developing solution with twice the volumn of formaldehyde soluition as indicated in the kit instructions (i.e. 100 μl per 250 ml rather than 50 μl per 250 ml).
3. Stain the gels according to the following protocol:
StepSolutionsAmountTime
FixationEthanol
Acetic acid, glacial
Make up to 500 ml with distilled water
200 ml
50 ml
2 x 60* min
SensitizingEthanol
Glutardialdehyde(25% w/v)
Sodium thiosulfate (5% w/v)
Sodium acetate (17 g)
Make up to 250 ml with distilled water
75 ml
1.25 ml
10 ml
1 packet
60 min
WashingDistilled water5 x 8 min
Silver reactionSilver nitrate solution (2.5% w/v)
Formaldehyde (37% w/v)
Make up to 250 ml with distilled water
25 ml
0.1 ml
60 min
WashingDistilled water4 x 1 min
DevelopingSodium carbonate (6.25 g)
Formaldehyde (3.7%)
Make up to 250 ml with distilled water
Stir vigorously to dissolve sodium carbonate
1 packet
100 μl
5 min
StopNa₂EDTA-H₂O (3.65 g)
Make up to 250 ml with distilled water
1 packet45 min
WashingDistilled water2 x 30 min
PreservationGlycerol (supplied at 87%, final conc. 4%)
Made up to 250 ml with distilled water
OR
Ethanol (10% v/v)††
Made up to 250 ml with distilled water
11.5 ml**

25 ml

20 min
* The first fixation may be prolonged up to 3 days if desired.
By omitting glytardialdehyde from the sensitizer and formaldehyde from the silver nitrate solution, as well as omitting the “preservative step”, the method becomes compatible with mass spectrophotometry analysis, although sensitivity is reduced. If glutardialdehyde and formaldehyde are to be used, add them just before staining.
The volumn of the formaldehyde in the developing solution can be varied from 100 μl up to 20 μl, depending on the amount of protein and the number of spots since formaldehyde is consumed in the developing reaction by proteins. Add the formaldehyde directly before use.
Approximate time; this step may be visually monitored. The gels should be transferred to stop solution when the spots have reached the desired intensity and before the staining background becomes too dark.
** For gels cast on plastic supports, increase the amount of glycerol to 25 ml.
†† Short-and long-term storage of gels is possible in 10% ethanol rather than glycerol, if gels are not being dried down. Glycerol is necessary only if planning to dry down gels. Storage in ethanol allows the gels to be compatible with spot picking / mass spectrometry.

 

Coomassie Blue R-350 Staining

Solution
(1) fixing solution : 10% Acetic acid 40% ethanol in 3DW.

(2) staining solution :

1. R-350 1 tablet / 120ml methanol + 80ml DW = total 200 ml
2. 20% Acetic acid 200ml (1) 번과 (2) 번을 1대 1로 섞어서 total 400 ml 으로 만듬.
(3) destaining solution : 30% methanol and 10% acetic acid in distilled water (3:1:6).

 

 

Protocol

Large gel ( 26 X 20 cm ) 한 장 당 250ml Solution 필요
(1) fixing : fixing solution에 30min ~ 3 hr 담근다.
(2) staining : Staining Solution에 6hr ~ overnight 담근다.
(3) Destaining : Destaining Solution으로 destaining 2시간 마다 갈아줌 –> destaining 되는 상태를 보면서 destaining solution을 갈아준다. 자주 갈아 줄 수록 빨리 빠짐.

Solution & Reagent Lists

1) 2D-Electrophoresis Solutions

Sample preparation solution (with urea) for 2-D electrophoresis
[8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM DTT, 25 ml]

Final concentrationAmount
Urea (FW 60.06)8 M*12 g
CHAPS†4% (w/v)1.0 g
DTT (FW 154.2)40 mM154 mg
Double-distilled waterto 25 ml (16 ml required)

* If necessary, the concentration of urea can be increased to 9 or 9.8 M.
Other neutral or zwitterionic detergents may be used at concentrations up to 2% (w/v). Examples include Triton X-100, NP-40, octyl
glucoside, and the alkylamidosulfobetaine detergents ASB-14 and ASB-16 (Calbiochem).
Store in 2.5-ml aliquots at -20 °C.
Note: Protease inhibitors may be added if necessary.

 

Sample preparation solution (with urea and thiourea) for 2-D electrophoresis
[7 M urea, 2 M thiourea, 4% CHAPS, 40 mM DTT, 25 ml]

Final concentrationAmount
Urea (FW 60.06)7 M10.5 g
Thiourea (FW 76.12)2 M3.8 g
CHAPS*4% (w/v)1.0 g
DTT (FW 154.2)40 mM154 mg
Double-distilled waterto 25 ml (13.5 ml required)

* Other neutral or zwitterionic detergents may be used at concentrations up to 2% (w/v). Examples include Triton X-100, NP-40, octyl
glucoside, and the alkylamidosulfobetaine detergents ASB-14 and ASB-16 (Calbiochem).
Store in 2.5-ml aliquots at -20 °C.

 

SDS equilibration buffer solution
(6 M urea, 75 mM Tris-HCl pH 8.8, 29.3% glycerol, 2% SDS, 0.002% bromophenol blue, 200 ml)*

Final concentrationAmount
Urea (FW 60.06)6 M72.1 g
Tris-HCl, pH 8.8 (see solution H)75 mM10.0 ml
Glycerol (87% w/w)29.3% (v/v)69 ml (84.2 g)
SDS (FW 288.38)2% (w/v)4.0 g
1% Bromophenol blue stock solution0.002% (w/v)400 μl
Double-distilled waterto 200 ml

* This is a stock solution. Just prior to use, add DTT or iodoacetamide (for first or second equilibration, respectively) as described in the
protocol in section 3.1.2.
Store in 20- or 50-ml aliquots at -20 °C.

 

10× Laemmli SDS electrophoresis buffer
(250 mM Tris base, 1.92 M glycine, 1% SDS, 10 l)*

Final concentrationAmount
Tris base (FW 121.1)250 mM303 g
Glycine (FW 75.07)1.92 M1441 g
SDS (FW 288.38)1% (w/v)100 g
Double-distilled waterto 10 l

* The pH of this solution should not be adjusted.
Store at room temperature.
See also Recipe M for 1× Laemmli SDS electrophoresis buffer.

 

30% T, 2.6% C monomer stock solution
(30% acrylamide, 0.8% N,N’-methylenebisacrylamide, 1 l)

Final concentrationAmount
Acrylamide (FW 71.08)30%300 g
N,N’-methylenebisacrylamide (FW 154.17)0.8%8 g
Double-distilled waterto 1 l

Filter solution through a 0.45-μm filter. Store at 4 °C in the dark.

 

4× resolving gel buffer solution
(1.5 M Tris base, pH 8.8, 1 l)

Final concentrationAmount
Tris base (FW 121.1)1.5 M181.7 g
Double-distilled water750 ml
HClaqadjust to pH 8.8
Double-distilled waterto 1 l

Filter solution through a 0.45-μm filter. Store at 4 °C.

 

Bromophenol blue stock solution

Final concentrationAmount
Bromophenol blue1%100 mg
Tris-base50 mM60 mg
Double-distilled waterto 10 ml

 

10% SDS solution
(10% SDS, 50 ml)

Final concentrationAmount
SDS (FW 288.38)10% (w/v)5.0 g
Double-distilled waterto 50 ml

Filter solution through a 0.45-μm filter. Store at room temperature.

 

10% ammonium persulfate solution
(10% ammonium persulfate, 10 ml and 1 ml)

Final concentrationAmount for 10 mlAmount for 1 ml
Ammonium persulfate (FW 228.20)10% (w/v)1.0 g0.1 g
Double-distilled waterto 10 mlto 1 ml

Filter solution through a 0.45-μm filter. Store at room temperature.

 

Gel storage solution
(375 mM Tris-HCl, 0.1% SDS, 1 l)

Final concentrationAmount
4× Resolving gel buffer (see solution H above)250 ml
10% SDS (see solution J above)0.1%10 ml
Double-distilled waterto 1 l

Store at 4 °C.

 

Agarose sealing solution
(25 mM Tris base, 192 mM glycine, 0.1% SDS, 0.5% agarose, 0.002% bromophenol blue, 100 ml)

Final concentrationAmount
Laemmli SDS electrophoresis buffer
(see solution M)
Agarose (NA or M)0.5%0.5 g
1% Bromophenol blue stock solution0.002% (w/v)200 μl

Add all ingredients into a 500-ml Erlenmeyer flask. Swirl to disperse. Heat in a microwave oven on low or on a
heating stirrer until the agarose is completely dissolved. Do not allow the solution to boil over. Dispense 1.5-ml
aliquots into screw-cap tubes and store at room temperature.

 

 

2) 2DE Reagent List

Sample preparation
17-1319-01
UREA, 500 G
RPN6301
THIOUREA 100GM
17-1314-01
CHAPS, 1G
17-1318-01
DITHIOTHRITOL (DTT), 1G
80-6501-23
Protease Inhibitor Mix
17-1329-01
BROMOPHENOL BLUE, 10 G
17-1335-01
DRYSTRIP COVER FLUID, 1000 ML
Equilibration chemicals
17-1325-01
GLYCEROL 87%, 1000 ML
17-1313-01
SDS 100 G
RPN6302
IODOACETAMIDE 25G
Casting chemicals and buffers
17-0554-02
AGAROSE NA, 100 G
17-1303-01
ACRYLAMIDE, 40%, 1000 ML
17-1306-01
METHYLENEBIS ACRYLAMIDE, 2% 1000 ML.
17-1312-01
TEMED, 25 ML
17-1321-01
TRIS, 500 G
17-1323-01
GLYCINE, 500 G
17-1311-01
AMMONIUM PERSULPHATE, 25 G
17-6002-50
ETTAN DALT II Buffer Kit: (for 12 gels)
Staining
17-1150-01
SILVER STAINING KIT, PROTEIN
17-0518-01
PHASTGEL BLUE R (40 TABLETS)
Ettan Sample preparation kits
80-6483-56
2D Quant Kit, 50 assays.
80-6484-51
2D Clean Up Kit , 50 samples.
17-6003-19
DeStreak Rehydration Solution, 5 X 3ml
80-6483-37
Sample Grinding Kit
28-9435-22
2D Protein Extraction buffer Trial Kit
28-9334-65
IPG box (1 IPG box + 1 IPG box kit)
28-9334-92
IPG box kit (10 Reswell Trays + Insert)
DryStrips and buffer
17-6001-11
IMMOBILINE DRYSTRIP PH3-10, 7Cm
17-6000-87
IPG-BUFFER, PH 3-10L
* 기타 다른 pH range별 list는 다음 페이지에 첨부 합니다.

 

 

3) IPG Strip & IPG buffer

ORDERING INFORMATION
ProductQuantityCode Number
Immobiline DryStrip gels, 24 cm
Immobiline DryStrip pH 3-5.6 NL, 24 cm
Immobiline DryStrip pH 5.3-6.5, 24 cm
Immobiline DryStrip pH 6.2-7.5, 24 cm
Immobiline DryStrip pH 7-11 NL, 24 cm
Immobiline DryStrip pH 3-11 NL, 24 cm
Immobiline DryStrip pH 5.5-6.7, 24 cm
Immobiline DryStrip pH 3-7 NL, 24 cm
Immobiline DryStrip pH 4-7, 24 cm
Immobiline DryStrip pH 6-9, 24 cm
Immobiline DryStrip pH 3-10 NL, 24 cm*
Immobiline DryStrip pH 3-10, 24 cm
12
12
12
12
12
12
12
12
12
12
12
17-6003-57
17-6003-62
17-6003-67
17-6003-72
17-6003-77
17-6002-38
17-6002-43
17-6002-46
17-6002-47
17-6002-45
17-6002-44
Immobiline DryStrip gels, 18 cm
Immobiline DryStrip pH 3-5.6 NL, 18 cm
Immobiline DryStrip pH 5.3-6.5, 18 cm
Immobiline DryStrip pH 6.2-7.5, 18 cm
Immobiline DryStrip pH 7-11 NL, 18 cm
Immobiline DryStrip pH 5.5-6.7, 18 cm
Immobiline DryStrip pH 4-7, 18 cm
Immobiline DryStrip pH 6-9, 18 cm
Immobiline DryStrip pH 6-11, 18 cm
Immobiline DryStrip pH 3-10 NL, 18 cm*
Immobiline DryStrip pH 3-10, 18 cm
12
12
12
12
12
12
12
12
12
12
17-6003-56
17-6003-61
17-6003-66
17-6003-71
17-6003-76
17-1233-01
17-6001-88
17-6001-97
17-1235-01
17-1234-01
Immobiline DryStrip gels, 13 cm
Immobiline DryStrip pH 3-5.6 NL, 13 cm
Immobiline DryStrip pH 5.3-6.5, 13 cm
Immobiline DryStrip pH 6.2-7.5, 13 cm
Immobiline DryStrip pH 7-11 NL, 13 cm
Immobiline DryStrip pH 3-11 NL, 13 cm
Immobiline DryStrip pH 4-7, 13 cm
Immobiline DryStrip pH 6-11, 13 cm
Immobiline DryStrip pH 3-10 NL, 13 cm*
Immobiline DryStrip pH 3-10, 13 cm
12
12
12
12
12
12
12
12
12
17-6003-55
17-6003-60
17-6003-65
17-6003-70
17-6003-75
17-6001-13
17-6001-96
17-6001-15
17-6001-14
Immobiline DryStrip gels, 11 cm
Immobiline DryStrip pH 3-5.6 NL, 11 cm
Immobiline DryStrip pH 5.3-6.5, 11 cm
Immobiline DryStrip pH 6.2-7.5, 11 cm
Immobiline DryStrip pH 7-11 NL, 11 cm
Immobiline DryStrip pH 3-11 NL, 11 cm
Immobiline DryStrip pH 4-7, 11 cm
Immobiline DryStrip, pH 6-11, 11 cm
Immobiline DryStrip pH 3-10, 11 cm
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12
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17-6003-54
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17-6003-74
18-1016-60
17-6001-95
18-1016-61
Immobiline DryStrip gels, 7 cm
Immobiline DryStrip pH 3-5.6 NL, 7 cm
Immobiline DryStrip pH 5.3-6.5, 7 cm
Immobiline DryStrip pH 6.2-7.5, 7 cm
Immobiline DryStrip pH 7-11 NL, 7 cm
Immobiline DryStrip pH 3-11 NL, 7 cm
Immobiline DryStrip pH 4-7, 7 cm
Immobiline DryStrip, pH 6-11, 7 cm
Immobiline DryStrip pH 3-10 NL, 7 cm*
Immobiline DryStrip pH 3-10, 7 cm
12
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12
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17-6003-53
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17-6003-63
17-6003-68
17-6003-73
17-6001-10
17-6001-94
17-6001-12
17-6001-11

 

ORDERING INFORMATION
ProductQuantityCode Number
IPG Buffer pH 3.5-5.0
IPG Buffer pH 4.5-5.5
IPG Buffer pH 5.0-6.0
IPG Buffer pH 5.5-6.7
IPG Buffer pH 4-7
IPG Buffer pH 6-11
IPG Buffer pH 7-11 NL
IPG Buffer pH 3-10 NL
IPG Buffer pH 3-10
IPG Buffer pH 3-11 NL
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
17-6002-02
17-6002-04
17-6002-05
17-6002-06
17-6000-86
17-6001-78
17-6004-39
17-6000-88
17-6000-87
17-6004-40

 

IPGstrip 별 IPG buffer
IPGstrip별_IPGbuffer-1

Basic Operation

Software

TroubleShooting

ImageMaster 2D Platinum v7.0

Demo e-license installation guide

사용하기 전 주의 사항

  1. Demo license는 2주간 사용 가능합니다.
  2. License 를 down 받기 전에 먼저 physical address 를 확인하시고 적어 두시기 바랍니다.
  3. 자세한 사용법은 프로그램 설치 후 Help에 user manual을 참고 하시기 바랍니다.
  4. System 사항

 

  • (1) 운영체제 : Window XP, Vista (영문판 권장, 사용자 계정이 영문으로 되어 있을 것)
  • (2) RAM : 최소 1G 이상 (2G권장)
  • (3) CPU : Pentium 4 이상
  • (4) 그래픽 : 24 bit 이상 (1024 X 768 pixel 이상) : 별도의 그래픽 카드가 장착되어 있는 system 이 있으면 더욱 좋습니다.

 

1. Physical address 확인하기


image 엑박 확인


 

2. IMPv7 Download 및 설치 하기

 

위의 사이트에 접속한다.

 

sw5

*E-mail : User information 을 적는다.
특히 E-mail은 Access Code가 전송되므로 정확히 적을 것. 단, hanmail은 피할 것. 간혹 방화벽에 막혀 스펨으로 처리 될 수 있으므로 주의.
→ Submit Click

 

 

sw6

Download Click → 아까 입력했던 email 로 들어가서 Access code확인

입력했던 email 계정으로 들어 가서 Access code 확인 하기

 

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Program 설치

다운로드 받았던 “ImageMaster 2D Pl 7.02.exe” 파일을 click

 

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License Down & Activation

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Image Master 2D Platinum v7 실행

 

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바탕화면에 Icon click

 

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실행완료!!!

Basic Operation

Software

TroubleShooting

IPGphor Operation Troubleshooting

증상가능한 해결책
LCD에 표시되는 에러 메시지
Lid open step 1, close to continue안전 리드가 제대로 닫히지 않았습니다. 안전리드가 열려있으면, 시스템은 안전을 위해 자동으로 전압을 끊도록 설계되어 있습니다. 프로토콜을 계속 진행하고 싶으시면, 안전 리드를 반드시 제대로 닫아야 합니다.
Locked screen in edit mode주 전원 스위치를 끄고 기계를 재 시작 하십시오.
Blank display만약 전자 부품이 작동하고 있지 않다면(HV 램프에 불이 들어오지 않는 경우, 냉각팬이 돌지 않는 경우 등), 주 전원 모듈의 퓨즈를 점검해 보십시오.
Diagnostic program indicates component faliurefail이라고 표시된 부품을 기록해 두시고, START버튼을 눌러 점검 과정을 모두 마치십시오. GE Healthcare 판매점에 전화하셔서 더 많은 정보를 요청하십시오.
전원 공급
전류가 너무 낮거나 0이다.안전 리드 밑에 IPGphorII의 리드 어댑터가 3개 있습니다. 그 중에서 적어도 2개는 스트립 홀더를 부드럽게 누르고 있어야 합니다. 그래야만 스트립 홀더의 전극들과 플랫폼의 전극영역간의 전기적 연속성이 유지됩니다.젤을 완전히, 고르게 rehydration시켜야 전류가 흐릅니다. 반드시 알맞은 양의 Rehydration 용액을 IPG 스트립 홀더에 넣어야 합니다. 그리고 rehydration에 최소한 10시간은 사용해야 합니다.
전압 한계에 도달하지 않는다.Rehydration 용액의 이온 세기가 너무 강합니다; IPG 버퍼의 농도를 낮추십시오; mixed-bed ion-exchange resin을 사용하여 UREA나 다른 첨가물에서 분해되어 나오는 이온성 물질들을 제거하십시오. 샘플에서 salt를 제거하십시오. 또는 salt의 농도가 10mM 이하가 되도록 샘플을 준비하십시오. 2D-Clean up kit을 사용하여, Salt를 제거할 수도 있습니다.
스트립이 탄다;
스트립에서 불꽃이 튄다.
전류 한계를 낮추십시오. 스트립당 50μA를 넘지 않도록 하십시오. Rehydration 버퍼에 스트립을 넣은 다음에는 즉시 Immobiline Drystrip Cover Fluid를 넣어 IPG 스트립이 마르지 않게 하십시오.스트립 전체가 완전히 rehydration되도록 하십시오. IPG스트립을 알맞은 양의 rehydration 버퍼에 넣어야 합니다. IPG스트립 아래에 거품이 생긴다면 rehydration의 효율을 위해 반드시 제거해야 합니다.샘플에서 salt를 제거하십시오. 또는 salt의 농도가 10mM 이하가 되도록 샘플을 준비하십시오.샘플 내에 과도하게 대전된 물질이나 rehydration 용액이 전기삼투현상(osmoelectric)을 일으킬 수 있습니다. 그 결과 스트립의 일부가 마를 수 있는데, 그 부분에서 불꽃이 튀거나 타는 현상이 나타납니다.

 

 

Manifold를 사용하는 경우

 

증상가능한 원인해결법
전압이 너무 낮거나 0이다.(1) 전기적 연속성이 깨졌다.외부의 전극이 잘 접촉되어 있는지 확인해보십시오: 전극 접촉 부분이 제대로 맞닿아 금속과 금속이 접촉되어야 합니다.내부의 전극이 잘 접촉되어있는지 확인해보십시오: rehydration 용액 속의 염료덕분에 젤을 눈으로 볼 수 있을 것입니다. 젤이 manifold의 양쪽 전극과 종이 심지 (electrode paper) 또는 종이 브릿지에 의해 접촉되어야 합니다.IPG 스트립이 완전히 rehydration되었는지 확인해 보십시오. 불완전한 rehydraion에 의해 전극의 전기적 접촉이 저해될 수 있습니다.종이 심지가 있는지, 적절한 위치에 있는지 확인해 보십시오.
전압이 너무 낮거나 세팅해 둔 최고 값까지 올라가지 않는다.(1) Ettan IPGphor 프로토콜 세팅이 실험에 적합하지 않다.전류 한계가 적절하게 세팅되었는지 확인해 보십시오.Ettan IPGphor 플랫폼에 설치된 Immobiline DryStrip 젤의 수가 프로토콜에 입력된 숫자과 같은지 확인해 보십시오.
(2) 전도성 / 이온세기가 너무 높다샘플의 salt 농도가 10mM 이하가 되도록 하십시오. IPG 버퍼의 농도를 0.5%로 사용하는 것을 추천합니다. 샘플의 용해도가 문제가 되는 상황에서는 최고 2%까지 사용하십시오. 또한 저급의 urea나 다른 denaturant를 사용하는 경우에도 전도성(conductivity)이 높아지는 경우가 있습니다. Urea는 분해되어 전극을 띤 부산물로 변하기도 합니다. 샘플 내의 전도성이 높거나, 이온성인 불순물이 스트립의 전도성을 높이는 경우도 있습니다.IPG스트립의 길이가 짧은 경우(예를 들어 7cm)에는 8000V까지 올라가지 않습니다.전극 사이의 거리가 짧으면 50μA 전류 한계에 도달하기 위해 필요한 전압 구배(V/cm)가 더 낮은 전압에서도 만들어질 수 있습니다.또는, IEF 프로토콜에서 전압을 최대로 올리기 전에 낮은 접압(50v~300V)이 얼마간 지속되는 과정을 첨가하십시오. 이렇게하면 이온들이 Immobiline DryStrip 젤의 끝으로 이동합니다.
낮은 전압(100V~500V) 인데도 전류가 50 μA 이상 올라간다.(1) 과저항이 걸렸다.종이심지(electrode paper)를 3DW에 충분히 적셨는지 확인하십시오. IPG buffer를 rehydration 용액과 마찬가지로 로딩 셈플에도 첨가하였는지 확인하십시오.
샘플이 컵에서 샌다.(1) 컵의 배치가 잘못되었다.컵의 발이 manifold 채널의 밑바닥에 제대로 놓였는지 확인하십시오.컵의 arm이 제대로 배치되었는지 확인하십시오.컵의 발이 채널 중심의 돌출부에 놓여있지 않은지 확인해 보십시오.컵을 Insert kit을 이용해서 수직으로 장착하십시오
(2) 스트립의 배치가 잘못되었다.스트립이 채널의 안쪽 정중심부에 있는지 확인해 보십시오
샘플 염료가 샘플컵 밖으로 나오지 않습니다.(1) 샘플컵에서 샘플 염료가 빠져나오려면 몇 시간 걸리는 것이 보통입니다.보통 1000V 이상부터 조금씩 빠지기 시작합니다.
(2) 샘플의 이온 세기가 젤에 비해 너무 셉니다. 그 결과 샘플 영역의 장력이 단백질을 적절한 속도로 밖으로 내보내기에는 약합니다.가능하면 샘플을 희석하십시오. 또는 로딩하기 전에 투석하여 salt를 없애십시오. 2D Clean-up Kit을 사용하셔도 좋습니다.
Immobiline DryStrip 젤에서 불꽃이 튀거나 탑니다.(1) 전류 한계 세팅이 너무 높다추천하는 전류 한계는 Immobilon DryStrip 젤당 50μA입니다. 이를 초과하여 세팅하지 마십시오.
(2) Immobiline DryStrip 젤이 완전히 rehydration되지 않았다Immobiline DryStrip 젤이 충분한 양의 rehydration 용액에 의해 rehydration되어야 합니다. Immobiline DryStrip 젤을 rehydration 용액에 담근 후, 젤 아래의 거품을 제거 하십시오.
(3) Immobiline DryStrip 젤이 IEF하는 중에 말랐다.Rehydration된 Immobiline DryStrip 젤이 다시 마르지 않도록 항상 Immobiline DryStrip Cover Fluid를 사용하십시오.IPGphor가 수평이 되었는지 확인하십시오.
Focusing후에 Immobiline DryStrip이 하얗고 불투명하게 변합니다.(1) Immobiline DryStrip 젤이 IEF하는 중에 말랐다.고전압 부분에서 ion 또는 단백질이 아닌 물질에 의해 저항이 걸렸다.Rehydration된 Immobiline DryStrip 젤이 다시 마르지 않도록 항상 추천된 양의 Immobiline DryStrip Cover Fluid를 사용하십시오.샘플에서 salt를 제거하십시오. 또는 salt의 농도가 10mM 이하가 되도록 샘플을 준비하십시오. 2D-Clean up kit을 사용하여, Salt를 제거할 수도 있습니다.
Immobiline DryStrip Cover Fluid가 manifold에서 넘칩니다.(1) Cover Fluid를 너무 많이 넣었다.IPGphor가 수평이 아니다.추천된 부피 이상을 넣지 마십시오. 트레이의 바깥쪽 가장자리에 기름이 없도록 하십시오.IPGphor가 수평이 되었는지 확인하십시오.

Vertical SDS-PAGE Troubleshooting

증상가능한 원인해결법
RUN을 시작할 때 전류가 흐르지 않습니다.(1) 위쪽 buffer chamber나 아래쪽buffer chamber에 버퍼의 양이 부족합니다.양쪽chamber에 충분한 양의 SDS 전기영동 버퍼를 담아 위아래의 전극선(백금선)에 닿도록 하십시오누수가 있는지 점검하십시오.누수가 있을 때는 gel seal 을 이용하거나 다시 재고정 하십시오.
2차원 분리가 너무 느리게 일어납니다.(1) SDS 전기영동 버퍼가 잘못 만들어졌습니다.
또는 resolving 젤 버퍼가 잘못 만들어 졌습니다.
용액을 새로 만드십시오.특히 resolving 젤 버퍼의 경우 pH 을 맞추시기 바랍니다.
(2) 전류가 샙니다.전기영동 유닛의 모든 슬롯이 젤이나 blank 카세트로 채워져 있는지 확인하십시오.
(3) 아크릴아마이드 용액이 너무 오래되었습니다.Monomer stock 용액을 새로 만드십시오.
양쪽 끝에 smile 현상 (가운데 부분의 dye가 빠르게 내려가는 현상) 이 일어납니다.(1) 젤의 온도가 일정하지 않습니다.열 순환기를 사용하여 젤의 온도를 조절하십시오. 보통 18℃~20℃로 세팅합니다. 아래쪽 chamber에 가능한 최대의 버퍼를 담으십시오. 혹은 max line까지 담으십시오.
(2) 전류나 전력이 너무 높습니다.전류나 전압을 다음과 같이 제한하십시오.
1 step: 1W~2W / gel 1 시간
2 step: 12W~15W / gel 3시간~5시간
찡그림 현상(가운데 부분의 dye가 천천히 내려가는 현상이 일어납니다.(1) 스페이서 근처에서 젤의 중합반응이 제대로 일어나지 않았습니다.젤 용액에서 가스를 없애십시오. 또는 ammonium persulfate와 TEMED의 양을 50%까지 늘리십시오.
(2) 기구가 부적절하게 조립되었습니다(SE 600 Ruby).개스킷이 조여지지 않았는지 확인해 보십시오.
(3) 위쪽 Chamber에 미세한 누수가 있습니다.위쪽Chamber에 버퍼를 충분히 담으십시오.
높은 전류에서 2차원 분리가 느리게 일어납니다.
(1) 어떤 슬롯에 젤 카세트나 blank 카세트가 들어있지 않습니다.
Anodic 버퍼가 cathodic 버퍼와 섞였습니다(Ettan DALT twelve systems).
전기영동 유닛의 모든 슬롯을 채우십시오.
제시된 부피(7.5L) 이상의 버퍼를 아래쪽Chamber에 붓지 마십시오.전기영동 유닛이 꽉 찼을때, Anode 버퍼의 수위가 sealing assembly보다 높아지지 않도록 해야 합니다. 만약 위쪽Chamber의 anode 버퍼가 초과되었으면, 파이펫으로 제거하십시오.Cathode 버퍼의 수위가 위쪽Chamber의 구석에 있는 공기 벤트보다 높아지지 않도록 해야 합니다.아래쪽Chamber에 bromophenol blue를 첨가하여 양쪽의 버퍼가 섞이지 않는지 확인해 보십시오. 1%(w/v) bromophenol blue 몇 방울이면 충분할 것입니다.
젤의 중합반응이 제대로 일어나지 않았습니다.
(1) 화학물질최고품질의 시약으로 만든 신선한 stock만을 사용하십시오. 만약 건조된 ammonium persulfate를 물에 넣었을 때 바스락거리는 소리가 나지 않으면, 신선한 stock으로 교체하십시오. TEMED 또는 / 그리고 ammonium persulfate의 농도를 높이십시오.
(2) 산소젤 환경에서 산소를 제거하십시오. Monomer 용액을 사용하기 전에 5~10분간 가스를 제거하십시오. 젤의 표면을 water saturated 1-butanol (water : buthanol = 50 : 50) 로 덮으십시오.
(3) 온도젤 용액의 온도를 최소 20℃로 맞추십시오. 특히 아크릴아마이드 농도가 낮은 젤의 경우엔 온도에 신경을 써야합니다.
DALT gel 12.5의 한쪽 혹은 양쪽에서 염료가 아래쪽으로 심하게 휘는 현상이 발견된다.
(1) 젤과 스페이서 사이에 채워지지 않은 빈 공간이 있습니다.Immobiline DryStrip 젤을 젤의 꼭대기에 둘 때, sealing 용액의 일부가 아래로 흘러서 혹시 있을지 모르는 빈 공간으로 들어 갔는지 확인하십시오.
(2) Precast Gel 카세트가 적절하게 닫히지 않았습니다.카세트를 적절하게 닫으십시오.

 

2D Image Result Troubleshooting

2-D의 결과로 본 문제 해결 지침

증상가능한 원인해결법
눈에 띄는 spot이 없다  
(1) 샘플이 불충분했다.샘플의 용해도가 낮아 충분한 양의 샘플이 Immobiline DryStrip 젤로 들어가지 못했다.샘플의 양을 늘리십시오.샘플 용액의 solubilizing components의 농도를 늘리십시오.
(2) 샘플에 focusing을 방해하는 불순물이 포함되어 있다.focusing하는 시간을 늘리거나 샘플 준비 방법을 바꾸십시오. 특히, Cell line을 셈플로 하는 경우 PBS를 제거 하십시오.
(3) pH gradient가 잘못되었다.Immobiline DryStrip의 ‘+’끝은 산성의 끝부분이며, anode(+)쪽을 향하고 있어야 합니다.
(4) Detection 방법이 충분히 민감하지 않다.다른 detection방법을 사용하십시오(coomassie blue 말고 silver staining을 사용하는 것).
(5) Detection 시약이 불량이다.염색 용액의 사용기한을 확인하십시오.
새로 만드십시오.
각 단백질들이 여러 개의 점으로 나타나거나, 안 나타나거나, 불분명하게 나타나거나, 잘못된 위치에 나타난다.(1) 단백질이 carbamylation되었다.Urea가 포함되어 있는 용액은 절대로 30℃이상으로 가열하지 마십시오. Urea의 분해물인 cyanate가 단백질을 carbamyation시켜서 pI를 바꾸기 때문입니다.
(2) 단백질이 oxidation되었다.DeStreak Rehydration 용액을 사용하십시오. equilibration하는 동안에 첫 번째 단계에서 DTT를 첨가하여 disulfide를 제거하십시오. 단백질이 reoxidation 되는 것을 막기 위해 두 번째 단계에서 Idoacetamine 을 첨가하여 thiol 그룹을 alkylation시키십시오.
2-D 패턴이 일그러졌다.(1) (vertical 젤 형식) 2차원 젤의 꼭대기 부분이 평평하지 않았다.젤을 부은 다음, 즉시 그 위에 water-saturated 1-butanol (water : butanol = 50 : 50) 을 부으십시오.
2D_1(1) (vertical 젤 형식) 젤의 중합반응이 고르게 일어나지 않았다. 이런 형상은 중합반응이 불완전하게 되었거나, 너무 빨리 일어났거나, 젤이 캐스팅되는 동안 누수가 있으면 발생한다.젤 용액에서 가스를 제거하십시오.중합반응의 속도는 ammonium persulfate와 TEMED의 양을 늘리면 (50%까지) 가속될 수 있습니다. 중합반응의 속도는 ammonium persulfate와 TEMED의 양을 줄이면 (33%까지) 감속될 수 있습니다젤을 캐스팅하는 동안 누수가 없도록 하십시오.
가로방향으로 streaking이 생기거나 불완전하게 focusing된 점들이 보인다(anode쪽에 샘플을 넣었는데, 이런 문제가 IPG 스트립의 anodic 끝부분에서 보이는 경우)
2D_2
(1) 너무 낮은 산성 pH에 셈플을 로딩했다.샘플과 Immobiline DryStrip안에 있는 IPG 버퍼의 농도를 높이십시오. 샘플에 alkaline IPG 버퍼를 약간 더 넣으십시오.샘플을 cathode에 넣으십시오.

* 주의: precipitation resolubilization을 반복하는 경우 가로방향의 streaking이 발생할 수 있습니다.

가로방향으로 streaking이 생기거나 불완전하게 focusing된 점들이 보인다(in gel rehydration loading하는 경우)
2D_3
(1) 샘플이 rehydration 용액에 제대로 용해되지 않았다.샘플 용액의 solubilizing components의 농도를 늘리십시오. IPG 버퍼의 농도를 높이십시오.
(2) focusing하는 시간이 충분히 길지 않아서 steady-state에 도달하지 못했다.Focusing 시간을 늘리십시오.
가로방향으로 streaking이 생기거나 불완전하게 focusing된 점들이 보인다(모든 방법 공통)
2D_4
(1) 방해 물질, 비단백질성 불순물이 샘플에 존재하여 IEF를 방해하고 있다.샘플 preparation방법을 바꿔서 이런 오염을 차단하십시오. 2-D Clean Up Kit를 사용하십시오.IEF 프로토콜을 변형하면 이온성 불순물의 효과를 줄일 수 있습니다. 전압을 2시간 동안 100-150V로 맞춰두시고, 그리고 나서 다시 일반적인 전압을 사용하는 단계로 들어가십시오. 이렇게 하면 샘플 속의 이온들이 Immbiline DryStrip 젤의 끝부분으로 이동합니다.
(2) 샘플에 이온성 detergent가 있다.만약 샘플을 준비하는 과정에서 이온성 detergent SDS가 사용되었다면, 투석 후 rehydration 용액에 넣었을 때 최종 농도가 0.25%을 넘지 않도록 해야 합니다. 그리고, 비이온성 detergent가 이온성 detergent의 농도보다 적어도 8배 이상 높아야 단백질로부터 SDS를 제거 할 수 있습니다.
젤에 가로방향으로 줄무늬가 생긴다.
2D_5
(1) Agarose 층에 불순물이 있거나, equilibration 용액에 불순물이 있다.Equilibration 용액과 agarose sealing solution 를 새로 준비하십시오.
샘플을 넣은 자리에 뚜렷하게 세로방향의 streak이 생겼다(Immobiline DryStrip 젤과 샘플컵에 로딩했을 때).
2D_6
(1) 샘플이 aggregation했거나 precipitation했다.샘플을 희석하고 더 많은 부피를 로딩하십시오.초반의 전압은 낮게 하고 점점 전압이 증가하도록 프로그램하십시오.
2-D 패턴에 수직방향의 틈이 있다.
2D_7
(1) 샘플에 불순물이 있다.샘플을 preparation 방법을 바꾸십시오.
(2) Rehydration 용액의 구성물질에 불순물이 있다.최고품질의 시약만 사용하십시오.Urea 용액을 deionize하십시오.
(3) Immobiline DryStrip 젤과 2차원 젤의 꼭대기 표면 사이에 거품이 있다.Immobiline DryStrip 젤과 2차원 젤의 꼭대기 표면 사이에 거품이 없게 하십시오.Immobiline DryStrip 젤이 vertical 젤 위에 단단하게 놓아서 그 아래에 거품이 없도록 하셔야 합니다. Immobiline DryStrip 젤이 놓인 부분의 플라스틱 밑받침을 forcep으로 부드럽게 두드려서 거품을 제거하십시오.
(4) Immobiline DryStrip 젤의 표면에 urea 결정이 있다.스트립을 2차원 젤 위에 두기 전에 남아있는 equilibration 용액이 Immobiline DryStrip 젤에서 urea를 흡수하게 하십시오.셈플에 salt의 농도가 높다면 저항 때문에 urea가 석출될 수도 있습니다.
분자량이 큰 단백질이 잘 나타나지 않는다.(1) 샘플의 단백질이 분해되고 있다.Protease inhibitor를 사용하시거나 단백질 분해를 저해하는 방식으로 샘플을 준비하십시오.
(2) Equilibration이 충분히 되지 않았다.Equilibration 시간을 늘리십시오.
(3) Immobiline DryStrip 젤에서 2차원 젤로 단백질이 transfer될 때 문제가 있었다.2차원 전기영동을 run할 때 처음 시작 단계를 낮은 전류 혹은 와트로부터 시작 하십시오.
(4) 샘플 단백질의 rehydration이 제대로 일어나지 않았다.추천해드린 부피의 Rehydration 용액을 사용하십시오.
점 streaking
2D_8
(1) (silver staining) 젤을 캐스팅할 때 더러운 판을 사용했거나 젤의 표면에 미립자 분순물이 묻었다. DTT와 다른 thiol 환원제가 이 문제를 심화시킨다.유리판을 잘 씻으십시오. Immobiline DryStrip 젤을 2차원 젤 에 로딩하기 전에 과량으로 들어갔거나 남아있는 thiol 환원제를 Iodoacetamide로 제거하십시오.
젤의 밑바닥 쪽으로 background가 번진다.(1) (silver or coomassie blue staining) carrier ampholyte를 염색했다.IPG 버퍼를 carrier ampholyte 혼합물로 사용하십시오. 만약 필요하다면 농도를 낮추십시오.fixing하는 시간을 늘리십시오.
젤의 위쪽으로 background가 번진다.(1) (silver staining) 샘플 안의 DNA, RNADNase와 RNase를 첨가하여 Nucleic acid를 분해하십시오.주의: DNase, RNase단백질이 2-D 맵에 나타날 것입니다.
젤의 윗부분에 background가 너무 많다.
2D_9
(1) SDS 전기영동 버퍼에 단백질이 섞여있거나 전기영동 유닛이 더럽다.SDS 전기영동 버퍼를 새로 만드십시오.전기영동 유닛을 씻으십시오.

 

 

Multiphor II System Troubleshooting

Multiphor II 전기영동 시스템과 Immobiline DryStrip Kit

증상가능한 원인해결법
샘플 컵이 샙니다.
(1) 샘플컵을 부적절하게 다루었고 배치가 잘못되었습니다.샘플컵은 깨지기 쉽습니다. 그러므로 너무 여러 번 사용하지 마십시오. 샘플컵을 Immobiline DryStrip과 잘 맞추어 사용하십시오. 샘플컵의 아래쪽이 Immobiline DryStrip 젤에 바짝 붙어야 합니다.주의: 샘플을 넣기 전에 누수가 발견될수도 있습니다.
* Immobiline DryStrip Cover Fluid를 Immobiline DryStrip kit tray에 넣을 때 잘 관찰하시면 누수를 발견할 수 있습니다. 만약 샘플 컵의 밑바닥에 누수가 있다면, 컵을 다시 위치시키십시오. pipet으로 cover fluid를 제거하십시오. 그리고 누수를 다시 점검하십시오.
* 누수를 점검하는 또 다른 방법으로는 0.01% bromophenol blue 염료 용액을 컵에 넣어보는 것이 있습니다. 만약 염료가 컵에서 새어 나온다면, 누수가 있는 것입니다. (중요: 이때 사용한 염료는 샘플을 로딩하게 전에 반드시 샘플컵에서 제거해야 합니다)
낮은 전류(1) Immobiline DryStrip 젤의 전도상(conductivity)이 낮기 때문에, 이는 정상적인 현상입니다.Immobiline DryStrip 젤은 보통 스트립당 50-100μA로 달리기 시작합니다. 그리고 점점 떨어져서 나중에는 스트립당 10μA 이하로 떨어집니다.
(2) EPS 3501XL 전원 공급기가 낮은 범위의 μA를 찾지 못하고 차단해 버린 것입니다.EPS 3501XL 전원 공급기는 매우 낮은 전류에서도 작동할 수 있기 때문에 Immobiline DryStrip kit, Immobiline DryStrip 젤과 함께 사용하는 것을 추천하고 있습니다. 차단된 낮은 전류가 bypass 되는지 확인해 보십시오. (EPS 3501XL 전원 공급기의 설명서를 보십시오)IPG의 경우에는 EPS 3501XL 전원 공급기가 감지하지 못하는 범위의 전류에서 시작하는 경우도 있습니다.
(3) IPG 버퍼가 rehydration 용액에서 빠졌습니다Rehydration 용액에는 언제나 IPG 버퍼 또는 Pharmalyte가 포함되어야 합니다. (0.5%~2%)
Run을 시작할 때 전류가 없습니다.(1) 전극 접촉이 되지 않았거나 전기적 전도성에 문제가 생겼다.모든 Multiphor II 가 제 위치에서 접촉되고 있는지 확인해 보십시오.전극 안의 금속 띠가 Immobiline DryStrip 트레이의 한쪽에 있는 금속 띠와 제대로 접촉되어야 합니다.전극내의 금속 띠가 붉은색 원과 검은색 원으로 표시된 끝부분에 있는지 확인해 보십시오냉각팬 아래의 브릿지 케이블이 제대로 설치되었는지 확인해 보십시오.
(2) Immobiline DryStrip젤이 제대로 rehydration되지 않았다.Immobiline DryStrip 젤의 모든 부분이 완전히 rehydration되게 하십시오.
(3) 전기영동 유닛의 고전압 리드가 전원 공급장치에 제대로 꽂히지 않았다.고전압 리드의 플러그를 전원공급장치에 확실하게 꽂으십시오. 만약 필요하다면 적당한 어댑터를 사용하십시오.
샘플 염료가 샘플컵 밖으로 나오지 않습니다.(1) 샘플컵에서 샘플 염료가 빠져나오려면 몇시간 걸리는 것이 보통입니다.보통 1000V 이상부터 조금씩 빠지기 시작합니다.
(2) 샘플컵을 아래쪽으로 너무 강하게 눌러서 컵이 젤을 통하여 플라스틱 뒷받침까지 누르고 있습니다. 이것은 전류를 막고 단백질이 Immobiline DryStrip 젤에 들어가는 것을 물리적으로 막습니다.Immobiline DryStrip 젤을 재위치 시키고, 샘플컵을 다시 올려놓으십시오.
(3) 샘플의 이온 세기가 젤에 비해 너무 셉니다. 그 결과 샘플 영역의 장력이 단백질을 적절한 속도로 밖으로 내보내기에는 약합니다.가능하면 샘플을 희석하십시오. 또는 로딩하기 전에 투석하여 salt를 없애십시오.
Immobiline DryStrip 젤에서 불꽃이 튀거나 탑니다. 
(1) 샘플의 전도성
(conductivity)이 Immobiline DryStrip 젤의 전도성에 비해 너무 높습니다.
샘플에서 salt를 적절한 방법으로 없애십시오.
또는, IEF 프로토콜에서 전압을 최대로 올리기 전에 낮은 접압이 얼마간 지속되는 과정을 첨가하십시오. 이렇게하면 이온들이 Immobiline DryStrip 젤의 끝으로 이동합니다.

 

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