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Electrophoresis Instrument

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Electrophoresis Instrument

Electrophoresis Instruments

Power Supply

Transfer Instruments

SDS-PAGE는 발현된 단백질의 Pattern확인 및 정성 그리고 정량분석을 하기위한 첫번째 technique으로써, 이를 위해 사용되는 장비에 대한 모식도 및 사용방법입니다.

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Electrophoresis Instruments

Power Supply

Transfer Instruments

기본적으로장비에전압, 전류를공급해주는장비로써, 각장비의모델마다지원가능한전압의크기, 전류의세기등이다르므로, 이부분에대한하기정보를확인하여야합니다.

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Power Supply Adaptor

(1) Adaptor (18-1129-59)

18-1129-59

(2) Adaptor (18-1129-58)

18-1129-58

Power Supply Adaptor 고르는 방법

_Ch08Electrophoresis2008-2009

ex) EPS1001에 TE 22를 사용하고 있다면, Adaptor 18-1129-59을 사용한다.

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Power Supply

Transfer Instruments

Polyacrylamide gel에옮겨진단백질을항원항체반응으로검출하기위해, membrane에이동시키는실험방법으로써, 그에사용되는장비입니다. 보통 Wet방식 (TE22, 62)과 Semi-dry방식 (TE 70, 77)으로나뉘게됩니다.

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Transfer를 효과적으로 할 수 있는 Tip

1) Buffer의 pH를 체크 한다. 만들고자 하는 pH에 근접하도록 하며, fresh한 buffer를 사용한다.

 

2) 3.5 mM SDS (0.1% SDS) transfer buffer를 사용한다.

 

3) Reagent grade chemical을 사용한다.

 

4) 다른 pH 를 가지는 transfer buffer 를 사용하여 protein의 net charge를 증가시킨다. 낮은 pH(<6–7)는 protein의 positive charge를 증가시키고, 높은 pH(>6–7)는 protein의 negative charge를 증가시킨다.

 

5) 만약 nitrocellulose membrane을 사용한다면, methanol은 사용하지 않는다.

TE70 Protocol – Transfer protocol

1) Transfer 할 running gel과 size가 똑같게 blotting paper와 membrane을 미리 자른다.

 

2) Running 이 끝난 SDS-PAGE 위쪽에 stacking gel 부분을 제거하고 running gel 을 transfer buffer 에 3 분~5 분 담근다.

 

3) Gel 을 transfer buffer 에 담그는 동안, PVDF membrane 경우 methanol 에 30 초간 적신 뒤, 바로 transfer buffer 에 3 분~5 분을 담근다. Nitrocellulose membrane 경우 바로 transfer buffer 에 3 분~5 분 담근다.

 

4) Blotting paper 를 transfer buffer 에 충분히 적신다.

 

5) TE70&TE77 transfer 의 아래 electrode 판에 blotting paper 3 장을 올려 놓고, 그 위에 membrane 을 올린다. Membrane 위에 running gel 을 올리고 그 위에 blotting paper 3 장을 올려 놓는다. (Fig 1)

 

6) 15ml tube 혹은 disposable pipet 을 stack 위에 살짝 눌러 굴리면서 stack 안에 있는 버블을 제거한다.

 

7) Stack 위에 0.3ml ~0.5ml 정도 transfer buffer 를 뿌리고 TE70&TE77 의 Electrode 뚜껑을 수직으로 닫는다.

 

8) Gel size 와 stack 개수에 맞게 mA를 설정한다. 예) 8 x 7 cm, stack 2장  45mA x 2(장)=90mA (Fig 2)

 

9) Transfer 시간은 1 시간 ~ 1 시간 30 분 사이에서 셋팅한다.

주의사항

• Blotting paper는 TE70&TE77에 동봉된 blotting paper (두께 약 0.5mm; 80-6211-29, 80-6211-67) 를 사용하는 것이 효율적이며, 얇은 blotting paper를 사용할 경우 아래 6장, 위에 6장 정도 올려서 사용한다.
• Blotting Paper를 Buffer에 충분히 적셔야 하며, Transfer 시 Voltage 가 Maximum (30V)까지 올라간 경우 Pause 시킨 뒤, Blotting Paper를 Transfer Buffer로 충분히 적셔 준다.
• Transfer 가 끝난 후 Electrode 접지 부분을 닦아줄 것.

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Fig 2. Recommended Current Settings for Different Gel Sizes

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Fig 3. Transfer Buffer



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