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ECL

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ECL

영문 설명서

화학발광

형광

ECL start

1) 실험계획 포인트

전기영동과 블로팅(Blotting) 까지는 한 번에 작업을 진행하므로 소요시간이나 준비를 확인합시다. (10 × 8 의 미니젤로는 전기영동 4 시간 , 블로팅 2 시간이 일반적입니다.) 항체희석률을 검토해 두면 확실한 결과를 얻을 수 있습니다. 전기영동과 블로팅(Blotting)은 가지고 계신 장비에 따른 Protocol를 참고 하십시오.

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2) 블로킹 (Blocking)

준비

 

(1) 검출까지 한번에 작업할 수 있도록 미리 준비해둡니다 .

  1. 블로킹제 (5% ECL Blocking Agent (RPN2125) in PBS-T or TBS-T 또는 5% Skimmed Milk in PBS-T or TBS-T) 의 조제
  2. 워시 버퍼 (PBS-T or TBS-T) 의 조제
  3. 1 차항체 , 2 차항체의 희석
  4. 암실 또는 검출 기기의 예약

 

(2) 블로팅(Blotting) 후의 막을 블로킹(Blocking) 솔루션에 담급니다 . (검출 후 , 백그라운드가 높아졌을 경우에는, PBS-T or TBS-T 의 Tween 20 농도 및 블로킹 시간, 온도를 조절합니다.)

 

(3) 실온에서 1 시간 교반합니다 .(막은 블로킹 버퍼 안에 4℃의 상태로 오버나이트로 반응하는 것도 가능 합니다.)

 

(4) 새로운 워시 버퍼로 바꾸어 교반 합니다. (2 분간 2번)
(1cm2 당 4ml 이상의 버퍼를 사용합니다. 8 × 10cm 의 막이라면 320ml 가 적절합니다.)

3) 1 차 항체 반응

(1) PBS-T or TBS-T 로 1: 10,000 희석한 1 차 항체에 막을 담급니다 . ( 1차항체 농도는 0.04~0.1 μg/ml 를 기준으로 실험을 시작합니다. 밴드가 가늘거나, 엑스트라 밴드가 생기는 등의 문제점이 발생한 경우에는 희석배율을 검토할 필요가 있습니다.)

 

(2) 실온에서 1 시간 교반합니다. (최적 반응시간 , 온도는 항체에 따라 다르므로 경우에 따라 새롭게 검토합니다.)

 

(3) 막을 새로운 워시 버퍼에 담근 후 교반하여 워시합니다 . 워시횟수는 다음과 같습니다. (2 분간×2 , 15 분간×1, 5 분간×3)
(1cm2 당 4ml 이상의 버퍼를 사용합니다. 8 × 10cm 의 막이라면 320ml 가 적절합니다.)

4) 2 차 항체반응

(1) PBS-T or TBS-T 로 희석한 HRP 표식 2 차 항체에 막을 담급니다 . 2 차항체의 희석배율은 X-선 필름의 노출시간을 10 분으로 할 경우, 10,000 배 희석이 적절합니다. ECL DualVue Western Blotting Markers 사용시에는 HRP 표식 S-protein 을 희석액에 첨가합니다 . ECL Western Blotting Molecular Weight Markers 사용시에는 HRP- conjugated Streptavidin (RPN1231-2ML, 1:1,500)을 희석액에 첨가합니다.

 

(2) 실온에 1 시간 교반합니다. (최적의 반응 시간 , 온도는 항체에 따라 다르므로 경우에 따라 새롭게 검토합니다.)

 

(3) 막을 새로운 워시 버퍼에 담근 후 실온에서 교반하여 워시합니다 . 워시횟수는 다음과 같습니다. (2 분간× 2, 15 분간× 1, 5 분간× 3)
(1cm2 당 4ml 이상의 버퍼를 사용합니다. 8 × 10cm 의 막이라면 320ml 가 적절합니다.)

5) 검출

X-선 필름 Hyperfilm ECL 을 이용한 검출방법

 

(1) 검출시약의 조제

  1. Solution A, Solution B 를 실온에서 평형화 시킵니다.
  2. Solution A: Solution B = 1 : 1 의 비율로 혼합합니다.

막 1cm2 당 0.1ml 의 검출시약이 필요합니다. 8 × 10cm 의 막의 경우는 8 ml Solution A, 200 μ l Solution B 를 기준으로 혼합합니다. 혼합시에 검출용액이 뿌옇게 흐려지는데, 정상입니다. 검출시약은 사용직전에 혼합하십시오. 불가피 하게 잠깐 동안 (1 시간 이내 ) 혼합해두는 경우 호일로 싸두거나, 어두운 곳에 보관합니다.

 

(2) 랩 위에 블랏면이 위로 향하도록 막을 놓고 , 전체를 덮도록 검출시약을 뿌립니다.
막에 여분의 워시 버퍼가 남아 있으면 백그라운드의 원인이 되므로 물기를 제거 한 후 수행합니다.

 

(3) 1 분간 , 실온에서 방치합니다.

 

(4) 막을 핀셋으로 조심스럽게 집어 올린 후 , 끝부분을 킴와이프스에 접촉하여 여분의 검출 시약을 제거합니다. (여분의 검출 시약이 남아 있으면 백그라운드의 원인이 됩니다.)

 

(5) 새로운 랩 위에 블랏면이 아래로 향하도록 막을 놓고 랩으로 쌉니다 . (기포가 들어가지 않도록 주의하십시오.기포의 영향으로 시그날이 약해질 가능성이 있습니다. 막을 강하게 누르지 않도록 하십시오.)

 

(6) 필름 카세트에 막을 블랏면이 위 (x 선 필름 쪽) 로 향하도록 놓습니다 . 그 위에 x 선 필름을 놓고 카세트를 덮습니다 . 적색안전광 아래서 작업하십시오. 필름 카세트 안에 검출 시약이 묻지 않도록 주의합니다.  x 선 필름의 오른쪽 끝을 접는 등 상하 , 앞뒤 면을 표시합니다.

 

(7) 15 초 ~ 수분간 노출시킵니다. (목적 단백질의 양이 미량이거나 , 시그날이 약할 경우에는 노출시간을 길게 합니다. 5 분 이상이 적절합니다.)

 

(8) x 선 필름을 현상합니다.

 

(9) 현상된 사진의 신뢰성을 평가합니다 검출 후의 막은 PBS-T or TBS-T 로 헹군 후 , 랩으로 싸서 2~8℃에 1 주일간 보관 가능합니다. 전체에 백그라운드가 보이는 경우에는 막을 PBS-T 혹은 TBS-T 로 10 분간 2 회 워시한 뒤, 다시 한번 5. 검출 부터 반복합니다.

ECL prime

1) 실험계획 포인트

전기영동과 블로팅(Blotting) 까지는 한 번에 작업을 진행하므로 소요시간이나 준비를 확인합시다. (10 × 8 의 미니젤로는 전기영동 4 시간 , 블로팅 2 시간이 일반적입니다 .) 항체희석률을 검토해 두면 확실한 결과를 얻을 수 있습니다.
전기영동과 블로팅(Blotting)은 가지고 계신 장비에 따른 Protocol를 참고 하십시오.

ecl_prime

2) 블로킹 (Blocking)

준비

 

(1) 검출까지 한번에 작업할 수 있도록 미리 준비해둡니다 .

  1. 블로킹제 (2% ECL Prime Blocking Agent in PBS-T or TBS-T) 의 조제,
  2. 워시 버퍼 (PBS-T or TBS-T) 의 조제,
  3. 1 차항체 , 2 차항체의 희석 (희석액은 2% ECL Prime Blocking Agent in PBS-T or TBS-T를 사용합니다.)
  4. 암실 또는 검출 기기의 예약

 

(2) 블로팅(Blotting) 후의 막을 블로팅의 막을 2% ECL Prime Blocking Agent in PBS-T or TBS-T 에 담급니다. (검출 후 , 백그라운드가 높아졌을 경우에는、PBS-T or TBS-T 의 Tween 20 농도 및 블로킹 시간, 온도를 조절합니다.)

 

(3) 실온에서 1 시간 교반합니다 .(막은 블로킹 버퍼 안에 4℃의 상태로 오버나이트로 반응하는 것도 가능 합니다.)

 

(4) 새로운 워시 버퍼로 바꾸어 교반 합니다. ( 2 분간 2번 )
(1cm2 당 4ml 이상의 버퍼를 사용합니다. 8 × 10cm 의 막이라면 320ml 가 적절합니다.)

3) 1 차 항체 반응

(1) 2% ECL Prime Blocking Agent in PBS-T or TBS-T로 희석한 1 차 항체에 막을 담급니다 . (1 차항체 농도는 Stock이 1mg/ml 일 때, 1,000~50,000 배를 기준으로 실험을 시작합니다. 밴드가 가늘거나, 엑스트라 밴드가 생기는 등의 문제점이 발생한 경우에는 희석배율을 검토할 필요가 있습니다.)

 

(2) 실온에서 1 시간 교반합니다. (최적 반응시간 , 온도는 항체에 따라 다르므로 경우에 따라 새롭게 검토합니다.)

 

(3) 막을 새로운 워시 버퍼에 담근 후 교반하여 워시합니다 . 워시횟수는 다음과 같습니다 . (2 분간×2 , 15 분간×1, 5 분간×3)
(1cm2 당 4ml 이상의 버퍼를 사용합니다. 8 × 10cm 의 막이라면 320ml 가 적절합니다.)

4) 2 차 항체반응

(1) 2% ECL prime Blocking Reagent in PBS-T or TBS-T 로 희석한 HRP 표식 2 차 항체에 막을 담급니다 . 2 차항체의 희석배율은 Stock이 1mg/ml 일 때 50,000 ~ 250,000 배로 입니다.)

 

(2) 실온에 1 시간 교반합니다.
(최적의 반응 시간 , 온도는 항체에 따라 다르므로 경우에 따라 새롭게 검토합니다.)

 

(3) 막을 새로운 워시 버퍼에 담근 후 실온에서 교반하여 워시합니다 . 워시횟수는 다음과같습니다. (2 분간× 2, 15 분간× 1, 5 분간× 3)
(1cm2 당 4ml 이상의 버퍼를 사용합니다. 8 × 10cm 의 막이라면 320ml 가 적절합니다.)

5) 검출

X-선 필름 Hyperfilm ECL 을 이용한 검출방법

 

(1) 검출시약의 조제

  1. Solution A, Solution B 를 실온에서 평형화 시킵니다 .
  2. Solution A: Solution B = 1 : 1 의 비율로 혼합합니다 .

막 1cm2 당 0.1ml 의 검출시약이 필요합니다. 8 × 10cm 의 막의 경우는 8 ml Solution A, 200 μ l Solution B 를 기준으로 혼합합니다. 혼합시에 검출용액이 뿌옇게 흐려지는데, 정상입니다. 검출시약은 사용직전에 혼합하십시오. 불가피 하게 잠깐 동안 (2 시간 이내 ) 혼합해두는 경우 호일로 싸두거나, 어두운 곳에 보관합니다 .

 

(2) 랩 위에 블랏면이 위로 향하도록 막을 놓고 , 전체를 덮도록 검출시약을 뿌립니다 . 막에 여분의 워시 버퍼가 남아 있으면 백그라운드의 원인이 되므로 물기를 제거 한 후 수행합니다 .

 

(3) 5 분간 , 실온에서 방치합니다 .

 

(4) 막을 핀셋으로 조심스럽게 집어 올린 후 , 끝부분을 킴와이프스에 접촉하여 여분의 검출 시약을 제거합니다 . (여분의 검출 시약이 남아 있으면 백그라운드의 원인이 됩니다.)

 

(5) 새로운 랩 위에 블랏면이 아래로 향하도록 막을 놓고 랩으로 쌉니다 . (기포가 들어가지 않도록 주의하십시오.기포의 영향으로 시그날이 약해질 가능성이 있습니다. 막을 강하게 누르지 않도록 하십시오.)

 

(6) 필름 카세트에 막을 블랏면이 위 (x 선 필름 쪽) 로 향하도록 놓습니다 . 그 위에 x 선 필름을 놓고 카세트를 덮습니다 . 적색안전광 아래서 작업하십시오 .필름 카세트 안에 검출 시약이 묻지 않도록 주의합니다. x 선 필름의 오른쪽 끝을 접는 등 상하 , 앞뒤 면을 표시합니다.

 

(7) 15 초 ~ 수분간 노출시킵니다. (목적 단백질의 양이 미량이거나 , 시그날이 약할 경우에는 노출시간을 길게 합니다. 1분~60분간이 적절합니다.)

 

(8) x 선 필름을 현상합니다.

 

(9) 현상된 사진의 신뢰성을 평가합니다.

 

 

CCD 카메라를 이용한 검출방법

 

(1) 검출시약의 조제

  1. Solution A, Solution B 를 실온에서 평형화 시킵니다.
  2. Solution A: Solution B = 1 : 1 의 비율로 혼합합니다.

막 1cm2 당 0.1ml 의 검출시약이 필요합니다. 8 × 10cm 의 막의 경우는 8 ml Solution A, 200 μ l Solution B 를 기준으로 혼합합니다. 혼합시에 검출용액이 뿌옇게 흐려지는데, 정상입니다. 검출시약은 사용직전에 혼합하십시오. 불가피 하게 잠깐 동안 (2 시간 이내 ) 혼합해두는 경우 호일로 싸두거나, 어두운 곳에 보관합니다.

 

(2) 랩 위에 블랏면이 위로 향하도록 막을 놓고 , 전체를 덮도록 검출시약을 뿌립니다 . 막에 여분의 워시 버퍼가 남아 있으면 백그라운드의 원인이 되므로 물기를 제거 한 후 수행합니다.

 

(3) 5 분간 , 실온에서 방치합니다.

 

(4) 막을 핀셋으로 조심스럽게 집어 올린 후 , 끝부분을 킴와이프스에 접촉하여 여분의 검출 시약을 제거합니다. (여분의 검출 시약이 남아 있으면 백그라운드의 원인이 됩니다.)

 

(5) 단백질이 있는 부분을 위로 하여 막을 CCD 카메라 sample tray 위에 그림과 같이 놓습니다.

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1) 실험계획 포인트

전기영동과 블로팅(Blotting) 까지는 한 번에 작업을 진행하므로 소요시간이나 준비를 확인합시다. (10 × 8 의 미니젤로는 전기영동 4 시간 , 블로팅 2 시간이 일반적입니다 .)
항체희석률을 검토해 두면 확실한 결과를 얻을 수 있습니다.
전기영동과 블로팅(Blotting)은 가지고 계신 장비에 따른 Protocol를 참고 하십시오.

ecl_select

2) 블로킹 (Blocking)

준비

 

1) 검출까지 한번에 작업할 수 있도록 미리 준비해둡니다 .

 

  1. 블로킹제 (5% ECL Blocking Agent (RPN2125) in PBS-T or TBS-T 또는 5% Skimmed Milk in PBS-T or TBS-T) 의 조제,
  2. 워시 버퍼 (PBS-T or TBS-T) 의 조제,
  3. 1 차항체 , 2 차항체의 희석 (희석액은 Suitable Blocking Agent in PBS-T or TBS-T 를 사용합니다.)
  4. 암실 또는 검출 기기의 예약

 

(2) 블로팅(Blotting) 후의 막을 블로팅의 막을 블로킹제(Blocking Solution)에 담급니다. (검출 후, 백그라운드가 높아졌을 경우에는、PBS-T or TBS-T 의 Tween 20 농도 및 블로킹 시간, 온도를 조절합니다)

 

(3) 실온에서 1 시간 교반합니다. (막은 블로킹 버퍼 안에 4℃의 상태로 오버나이트로 반응하는 것도 가능 합니다)

 

(4) 새로운 워시 버퍼로 바꾸어 교반 합니다.(2 분간 2번)
(1cm2 당 4ml 이상의 버퍼를 사용합니다. 8 × 10cm 의 막이라면 320ml 가 적절합니다)

3) 1 차 항체 반응

(1) 블로킹제(Blocking Solution)로 희석한 1 차 항체에 막을 담급니다. (1 차항체 농도는 Stock이 1mg/ml 일 때, 5,000~30,000 배를 기준으로 실험을 시작합니다. 밴드가 가늘거나, 엑스트라 밴드가 생기는 등의 문제점이 발생한 경우에는 희석배율을 검토할 필요가 있습니다.)

 

(2) 실온에서 1 시간 교반합니다. (최적 반응시간 , 온도는 항체에 따라 다르므로 경우에 따라 새롭게 검토합니다.)

 

(3) 막을 새로운 워시 버퍼에 담근 후 교반하여 워시합니다 . 워시횟수는 다음과 같습니다. (5 분간×3~6회)
(1cm2 당 4ml 이상의 버퍼를 사용합니다. 8 × 10cm 의 막이라면 320ml 가 적절합니다)

4) 2 차 항체반응

(1) 블로킹제(Blocking Solution)로 희석한 HRP 표식 2 차 항체에 막을 담급니다. 2 차항체의 희석배율은 Stock이 1mg/ml 일 때 100,000 ~ 300,000 배 입니다.)

 

(2) 실온에 1 시간 교반합니다 .
(최적의 반응 시간 , 온도는 항체에 따라 다르므로 경우에 따라 새롭게 검토합니다.)

 

(3) 막을 새로운 워시 버퍼에 담근 후 실온에서 교반하여 워시합니다 . 워시횟수는 다음과 같습니다 . (5 분간×3~6회)
(1cm2 당 4ml 이상의 버퍼를 사용합니다. 8 × 10cm 의 막이라면 320ml 가 적절합니다.)

5) 검출

X-선 필름 Hyperfilm ECL 을 이용한 검출방법

 

(1) 검출시약의 조제

  1. Solution A, Solution B 를 실온에서 평형화 시킵니다 .
  2. Solution A: Solution B = 1 : 1 의 비율로 혼합합니다 .

막 1cm2 당 0.1ml 의 검출시약이 필요합니다. 8 × 10cm 의 막의 경우는 8 ml Solution A, 200 μ l Solution B 를 기준으로 혼합합니다. 혼합시에 검출용액이 뿌옇게 흐려지는데, 정상입니다. 검출시약은 사용직전에 혼합하십시오. 불가피 하게 잠깐 동안 (2 시간 이내 ) 혼합해두는 경우 호일로 싸두거나, 어두운 곳에 보관합니다 .

 

(2)랩 위에 블랏면이 위로 향하도록 막을 놓고 , 전체를 덮도록 검출시약을 뿌립니다 .
막에 여분의 워시 버퍼가 남아 있으면 백그라운드의 원인이 되므로 물기를 제거 한 후 수행합니다 .

 

(3) 5 분간, 실온에서 방치합니다 .

 

(4) 막을 핀셋으로 조심스럽게 집어 올린 후 , 끝부분을 킴와이프스에 접촉하여 여분의 검
출 시약을 제거합니다 . (여분의 검출 시약이 남아 있으면 백그라운드의 원인이 됩니다.)

 

(5) 새로운 랩 위에 블랏면이 아래로 향하도록 막을 놓고 랩으로 쌉니다. (기포가 들어가지 않도록 주의하십시오.기포의 영향으로 시그날이 약해질 가능성이 있습니다. 막을 강하게 누르지 않도록 하십시오.)

 

(6) 필름 카세트에 막을 블랏면이 위 (x 선 필름 쪽) 로 향하도록 놓습니다. 그 위에 x 선 필름을 놓고 카세트를 덮습니다. 적색안전광 아래서 작업하십시오 .필름 카세트 안에 검출 시약이 묻지 않도록 주의합니다. x 선 필름의 오른쪽 끝을 접는 등 상하, 앞뒤 면을 표시합니다

 

(7) 15 초 ~ 수분간 노출시킵니다. (목적 단백질의 양이 미량이거나, 시그날이 약할 경우에는 노출시간을 길게 합니다. 1분~60분간이 적절합니다.)

 

(8) x 선 필름을 현상합니다.

 

(9) 현상된 사진의 신뢰성을 평가합니다.

 

CCD 카메라를 이용한 검출방법

 

(1) 검출시약의 조제

  1. Solution A, Solution B 를 실온에서 평형화 시킵니다 .
  2. Solution A: Solution B = 1 : 1 의 비율로 혼합합니다 .

막 1cm2 당 0.1ml 의 검출시약이 필요합니다. 8 × 10cm 의 막의 경우는 8 ml Solution A, 200 μ l Solution B 를 기준으로 혼합합니다. 혼합시에 검출용액이 뿌옇게 흐려지는데, 정상입니다. 검출시약은 사용직전에 혼합하십시오. 불가피 하게 잠깐 동안 (2 시간 이내 ) 혼합해두는 경우 호일로 싸두거나, 어두운 곳에 보관합니다 .

 

(2)랩 위에 블랏면이 위로 향하도록 막을 놓고 , 전체를 덮도록 검출시약을 뿌립니다 .
막에 여분의 워시 버퍼가 남아 있으면 백그라운드의 원인이 되므로 물기를 제거 한 후 수행합니다 .

 

(3) 5 분간 , 실온에서 방치합니다 .

 

(4) 막을 핀셋으로 조심스럽게 집어 올린 후 , 끝부분을 킴와이프스에 접촉하여 여분의 검
출 시약을 제거합니다 . (여분의 검출 시약이 남아 있으면 백그라운드의 원인이 됩니다.)

 

(5) 단백질이 있는 부분을 위로 하여 막을 CCD 카메라 sample tray 위에 그림과 같이 놓습니다.

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(6) CCD 이미징 장비 중 sample tray 놓는 부분에 tray를 놓고 60초간 CCD 카메라 매뉴얼에 따라서 60초간 노출 시킵니다.  (LAS의 경우 실험길라잡이 LAS 4000편 ImageReader 소프트웨어사용법 참조)

 

(7) 현상된 사진의 신뢰성을 평가합니다.

화학발광

형광

ECL plex

1) 실험계획 포인트

전기영동과 블로팅(Blotting) 까지는 한 번에 작업을 진행하므로 소요시간이나 준비를 확인합시다. (10 × 8 의 미니젤로는 전기영동 4 시간 , 블로팅 2 시간이 일반적입니다 .)
항체희석률을 검토해 두면 확실한 결과를 얻을 수 있습니다. 전기영동과 블로팅(Blotting)은 가지고 계신 장비에 따른 Protocol를 참고 하십시오.
기본조작은 화학 발광검출과 같지만 , 형광검출의 경우에는 다음과 같은 점을 주의하십시오. 형광검출 성공의 비결은 백그라운드를 낮게 억제하는 것에 있습니다 . 블로킹 , 워시 시의 버퍼량은 막 1cm2 당 2.5ml 이상을 사용하는 것을 추천합니다 . 워시 시에는 막이 충분히 들어갈 크기의 용기를 준비합니다 . 용기를 사용하기 전에 물과 에탄올로 워시합니다 .막이 마르지 않도록 주의하십시오. Powder-free 의 글로브를 사용합니다 .
CBB, BPB, 볼펜의 잉크 , Triton X-100 등이 섞여 들어가는 것은 백그라운드에 영향을 미치므로 주의하십시오. 젤 하단의 BPB 를 포함하는 부분도 잘라냅니다.

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