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Protein Purification

Protein Purification

Dynamic Binding Capacity Evaluation

단일클론항체 정제에서 Mabselect Sure를 이용한 용출조건 최적화

Scale up Scenario

Mab Select Sure Elution Optimization using ÄKTA avant DoE

Summary

Long residence time에서 Mabselect Sure LX 미디어는 기존 Mabselect Sure 미디어에 비해 20-45% 정도 높은 DBC 값을 지닌다.

 

 

Introduction

Affinity media인 Mabselect Sure와 Mabselect Sure LX에 대해 동일 항체/조건을 비교하였을 경우, long residence time에서 Mabselect Sure LX가 높은 DBC 값을 가지는 것을 확인해보고자 하였다.

 

 

Materials & Experiment Conditions

  • Media: MabSelect Sure, Mabselect Sure LX
  • Column: HiScreen (Bed height: 10 cm, Column vol: 4.7 ml)
  • Sample: 3mg/ml IgG in adsorption buffer
  • Condition:
Media
Residence time: 6 min
Residence time: 8 min
Mabselect Sure
CASE 1
CASE 3
Mabselect Sure LX
CASE 2
CASE 4

 

 

Result

Media
DBC, 10%
@ 6 min
DBC, 10%
@ 8 min
Mabselect Sure
CASE 1
55.5 mg/ml
CASE 3
49.8 mg/ml
Mabselect Sure LX
CASE 2
65.1 mg/ml
CASE 4
71.5 mg/ml

 

 

Conclusion

위에서 열거한 결과를 기존 본사 제공된 application note의 DBC graph와 비교하였을 경우, 실제 실험 결과는 다음과 같이 표시될 수 있다.
Mabselect Sure (CASE 1 & 3): 2_1
Mabselect Sure LX (CASE 2 & 4): 2_2

2_3

이 결과는 이번 실험의 결과가 본사 제공한 데이터와 유사한 경향을 가지고 있음을 볼 수 있으며Mabselect LX의 경우 Residence time이 6분 이상인 경우 Mabselect sure 대비 20-45% 정도 Q10%,B값이 증가함을 확인할 수 있었다.

 

 

Figure

2_4
2_5
2_6
2_7
2_8
2_9
2_10
2_11

 

 

References

Instructions 28-9765-00 AA, MabSelect SuRe™ LX

Application note 28-9875-25 AA, Dynamic binding capacity study on MabSelect SuRe™ LX for capturing high-titer monoclonal antibodies

Dynamic Binding Capacity Evaluation

단일클론항체 정제에서 Mabselect Sure를 이용한 용출조건 최적화

Scale up Scenario

Mab Select Sure Elution Optimization using ÄKTA avant DoE

Summary

Mabselect Sure에서의 용출조건 변화에 따른 최적화 전략

  • pH level: pH가 낮으면 용출력이 강하나 안정성이 떨어지고, pH가 높으면 안정성은 좋으나 용출력이 낮아지므로 용출된 단일클론항체의 특성에 따른 적절한 pH 조건 선택
  • Stabilizer/Enhancer: 낮은 pH에서의 단일클론항체의 안정성을 높이기 위해 NaCl 등의 Stabilizer를 사용하거나, 높은 pH에서의 용출력을 향상시키기 위한 Urea 등 사용
  • pH 전환도: 버퍼농도에 따른 pH 전환에 따라 용출되는 패턴이 달라지며 일반적으로 빠른 pH 전환이 선호됨

 

 

Introduction

세포배양을 통해 얻은 단백질을 정제할 경우, 첫번째 Capture 단계는 세포에서 유래된 효소 (특히, protease) 들로 인한 단백질 변성들을 방지하고 기타 유래된 불순물들을 제거하기 위한 가장 중요한 단계입니다. Capture 단계의 경우, 정제의 주요 factor인 수용력(Capacity), 품질 (Quality & Resolution), 수율 (Yield & Recovery), 속도 (Speed) 중에서 많은 양(High capacity)을 빠른 시간(high speed)안에 정제하는 것이 중요합니다. 이 단계에서 항체의 경우 친화성을 이용한 Protein A 컬럼을 사용하는 것이 많은 장점이 있으며, 이 경우 기본적으로 중성 pH 조건에서 흡착을 시킨 뒤, 낮은 pH를 이용하여 목적물질을 탈착시키게 됩니다. 하지만, 낮은 pH에서는 단백질의 변성이 일어나기 때문에 안정제 또는 용출을 돕기위한 enhancing agent들을 첨가하기도 하며, buffer 자체의 농도를 조절하기도 합니다. 이러한 과정에서 목적물질이 잘 탈착되면서도 안정성을 유지하는 적절한 조건을 선별하는 것이 필요합니다.

MabselectSure_1

 

 

Purpose

이번 application note에서는 단일클론항체를 정제하기 위해서, Akali-stable하여 CIP (cleaning-in-place)가 용이하도록 디자인된 Mabselect Sure 컬럼을 사용하여 용출 pH 조건 검색 및 첨가제 또는 pH 전환에 대한 조건을 찾는 실험을 하였습니다. 즉, 각각의 조건에서 정제된 검체를 가지고, 흡광도를 이용한 단백질 정량, SEC를 통한 응집체 (Dimer/Aggregate, D/A) 비율 분석 및 용출 부피와 pH 등의 분석을 함으로서 1> 수율이 높고, 2> 응칩체의 비율이 낮으면서도, 3> 다음 단계를 위한 용출볼륨이 작은 조건을 찾는 최적화 실험을 진행하였습니다.

 

 

Materials & Experiment Conditions

  • 컬럼: MabSelect SuRe packed in Tricon5/10 (CV=2ml)
  • 시스템: ÄKTASystem (ÄKTAavant, ÄKTApurifier plus)
  • 유속: 250cm/hr (RT: 2.4 min for 10cm bed height)
  • 검체: 22 ml * CHO-CCF (검체 내 단클론항체 농도 – 약 1.8mg/ml)
  • 버퍼: Phosphate buffer +150mM NaCl (pH 7.4), Citrate buffer (pH 3.2-3.8) with/without additives

 

실험
목적
buffer A (loading buffer)
buffer B (elution buffer)
실험 1
pH 검색
20mM Phosphate + 150mM NaCl
20mM Citrate (pH 3.2/3.4/3.6/3.8)
실험 2
용출력↑
20mM Phosphate + 150mM NaCl
20mM Citrate + 1M Urea
안정도↑
20mM Phosphate + 150mM NaCl
20mM Citrate + 0.1M NaCl
실험 3
pH전환도
20mM Phosphate + 150mM NaCl
100mM Citrate (for sharp curve)
50mM Phosphate + 150mM NaCl
10mM Citrate (for shallow curve)

 

 

Analysis

  • pH측정: pH monitor
  • 농도측정: UV Absorbance at 280nm
  • Dimer/Aggregate (D/A) : SEC on Superdex 200 in Tricorn 10/300

 

 

Experiments

실험 1: 용출 pH 조건 검색

단클론 항체의 경우 대부분 중성 pH에서 protein A 리간드에 흡착하고 산성조건에서 탈착되게 됩니다. 산성도가 높을수록 용출력이 높아지지만 단백질의 변성도도 같이 올라가기 때문에 해당 검체에서의 적절 조건을 찾기 위해 pH 3.2~3.8 용출 조건에 대해서 실험을 진행하였으며, 각 조건에서의 용출된 검체에 대해 침전물 (육안) 또는 이량체/응집체의 생성여부 (SEC), 산출량 계산을 위한 농도 측정 (UV)를 측정하여 평가를 진행하였습니다.
MabselectSure_2
<그림 1. Mabselect Sure column에서의 chromatogram의 예시>
MabselectSure_3
<그림 2. Superdex 200 column에서의 chromatogram의 예시>

 

이에 대한 결과를 요약하면 아래와 같습니다.

 

pH
Pool vol
Precipitation
D/A (%)
Yield (conc.)
pH 3.2
2.5 CV
O
22%
78%
pH 3.4
2.5 CV
O
9%
80%
pH 3.6
6 CV
X
1.1%
89.1%
pH 3.8
8 CV
X
0.33%
54.6%

 

기본적으로 1단계에서의 응집체의 비율은 10%가 넘지 않는 것이 좋습니다. 이러한 조건에서 Yield가높은 pH 3.4와 3.6를 비교하자면, pH 3.6은 침전도 없고 응집체의 비율은 높지만 용출부피가 상대적으로 너무 크며, pH 3.4의 경우는 용출부피는 적절하지만 침전물이나 응집체의 형성이 상대적으로 높은 부분이 있습니다. 이 두 조건을 이용하여 실험 2에서 각 조건에 대한 modification을 진행하였습니다.

 

 

실험 2: 용출 조건 최적화

실험 1에서 검색된 조건에 대해서 pH 3.6의 경우는 상대적으로 높은 pH에서 단백질의 안정성은 높아졌지만 용출력이 작아져서 용출부피가 늘어났기 때문에 해당 pH에서 용출력을 늘려줄 수 있는 enhancer로서 Urea를 사용하였습니다. 반대로 pH 3.4의 경우는 용출부피는 적절하지만 산성도에 따른 단백질의 변성을 낮추기 위해 안정제로서 NaCl을 사용하여 실험을 진행하였으며, 각각의 실험은 실험 1과 동일한 방법으로 결과를 분석하였습니다.

용출력을 증가시키기 위한 첨가제를 사용한 실험 비교 결과는 아래와 같습니다.

 

Elution Buffer
Elution vol
Precipitation
D/A
Yield
실험1
20mM Citrate (pH 3.6)
6.0 CV
X
1.1 %
89.1 %
실험2
상동+1M Urea (pH 3.6)
3.0 CV
X
4.6%
87.5 %

 

Urea를 첨가한 경우 비슷한 level의 Yield와 낮은 D/A level을 유지하면서도 용출력의 증가로 인해 용출부피가 50% 정도 줄어든 것을 볼 수 있었습니다.

낮은 전도도에서의 항체의 안정성이 저하되는 경향이 있기 때문에 안정제의 일종으로 NaCl을 첨가하여 실험한 결과는 아래와 같습니다.

 

Elution Buffer
Elution vol
Precipitation
D/A
Yield
실험1
20mM Citrate (pH 3.4)
2.5 CV
O
9.0 %
80.0 %
실험2
상동+100mM NaCl (pH 3.4)
3 CV
X
3.2 %
82.6 %

 

NaCl을 첨가한 경우 침전물의 생성도 관찰되지 않으면서도 D/A level도 60% 정도 낮아진 것을 통하여 전반적인 안정성이 높아진 것을 확인할 수 있었습니다.

 

 

실험 3: buffer strength에 따른 pH 전환도 영향 조사

Buffer
pH 전환시 소요된 Vol
Precipitation
D/A
Yield
실험3A
(Sharper)
20mM Phosphate
–> 100mM Citrate
1.1 CV
X
6.0 %
77.8 %
실험1
(Standard)
20mM Phosphate
–> 20mM Citrate
1.1 CV
O
9.0 %
77.8 %
실험3B
(Shallower)
50mM Phosphate
–> 10mM Citrate
2.5 CV
O
4.4 %
74.4 %

 

Buffer 농도에 따라서 pH 전환에 걸리는 용량이 달라지는 것을 볼 수 있으며, 각각의 경우 침전물의 생성여부를 볼 수 있었습니다.

pH 전환도가 sharp한 경우와 shallow 한 경우에 따른 크로마토그램의 profile은 아래의 그래프를 통해 살펴보도록 하겠습니다.

 

MabselectSure_4

 

Elution buffer의 buffer strength가 강한 경우에는 pH가 sharp하게 변하기 때문에 앞쪽에서 elution이 일어나게 되며 피크가 sharp하게 나타나며, binding buffer의 strength가 강하고 elution buffer strength가 약한 경우에는 binding buffer에서의 완충효과가 크게 나타나기 때문에 pH 전환이 느리게 나타나면서 elution peak가 뒤쪽에서 나타나면서도 약간 broad해지는 경향을 볼 수 있습니다. 이를 보아서 pH전환이 sharp 한 경우, 용출부피가 작으면서도 용출버퍼의 농도에 따른 전도도가 높아짐에 따른 안정성이 높아져서 침전물도 관찰되지 않은 것을 기반으로 pH 전환이 shallow한 것에 비해 이로움을 관찰하였습니다.

 

 

Conclusion

상기의 실험에서 해당 단일클론항체의 경우, 수율과 용출부피 및 응집체의 비율을 고려하여 pH 3.4와 pH 3.6의 조건을 선택하여 각각의 조건을 향상할 수 있도록 실험을 설계하였습니다. 즉, pH 3.4의 경우에서는 응집체의 비율을 줄일 수 있도록 안정제를 첨가하는 전략과, pH 3.6의 경우에는 용출부피를 줄일 수 있는 향상제를 첨가하는 전략을 사용하여 해당 조건에서의 향상된 점을 확인하였습니다. 또한 buffer 자체의 농도를 변화시켜 pH의 transition rate가 정제에 미치는 영향을 통해 기본적으로는 빠른 pH 전환이 정제 조건을 조금 더 향상시킬 수 있는 점도 확인할 수 있었습니다.

이러한 결과를 통해 단일클론항체를 protein A 컬럼을 사용하여 정제할 경우 낮은 pH에서는 용출력은 높아서 쉽게 흡착된 물질이 분리되지만 안정성이 낮아 침전물이나 응집물이 생기기 쉽기 때문에 목적 단백질의 특성에 적절한 pH를 찾는 것이 필요함을 확인하였습니다. 또한 선택한 pH 조건에서 Enhancer/Stabilize와 같은 첨가제를 사용하는 경우, 안정성 증가 (침전X, D/A level 60% 감소) 및 용출력 증가에 따른 용출부피가 50% 줄어든 것을 통해 목적에 따른 결과가 향상됨을 관찰하였습니다. 마지막으로 흡착과 탈착에 사용된 buffer 농도에 따른 pH 전환도에 따라 용출부피의 감축 및 목적 단백질의 안정성이 다름을 살펴봄으로서 빠른 pH 전환이 프로세스에 유리함을 확인할 수 있었습니다.

이번 실험에서는 단순히 수율과 응집체 비율 등으로 평가를 진행하였지만, 추가적으로 단백질의 특성에 맞는 추가적인 분석이 실제의 프로세스에는 필요합니다. 하지만 이번 실험을 통한 이해도를 기반으로 “조건 screening –> 프로세스 최적화 조건 적용 –> 프로세스 조건 확립” 과 같은 정제 전략을 실제 조건에서 적용할 수 있을 것입니다.

References

Affinity Chromatography & Experimental Parts in FastTrak MAB1 Training, GE Healthcare Lifesciences

관련자료

Dynamic Binding Capacity Evaluation

단일클론항체 정제에서 Mabselect Sure를 이용한 용출조건 최적화

Scale up Scenario

Mab Select Sure Elution Optimization using ÄKTA avant DoE

Introduction

B사에서 진행한 C프로젝트에서는 연구단계에서 optimization을 진행한 후, 파일롯 단계로의 스케일업을 진행하였으며, 이에 대한 chromatogram 및 분석값으로 해당 스케일업의 적절성을 평가하고자 하였다.

 

 

Materials & Experiment Conditions

  • Process Media: MabSelect Sure
  • Scale up Factor: 40 X
  • Sample: mAb 배양액

 

Scale
Column
System
Column Vol
Bed height
Flow rate
Lab Scale
XK16/40
ÄKTAavant150
40 ml
20 cm
200 cm/h
Pilot Scale
BPG100
ÄKTApilot
1.6 L

 

 

Results

Scale_up_Scenario_1
<Fig1. Chromatogram from XK16 column packed with Mabselect Sure>

 

Scale_up_Scenario_2

<Fig2. Chromatogram from BPG100 column packed with Mabselect Sure>

 

 

Conclusion

흡착 크로마토그래피에서 가장 고려해주어야 하는 것은 동일한 residence time을 가지도록 하는 것으로 상기 실험에서는 단클론항체 배양액을 일차적으로 정제하기 위해 친화성 교환 수지인 Mabselect Sure를 20cm의 bed height를 200cm/h의 flow로 흘려주어 residence time을 6분으로 유지시켜주으며, 해당 실험결과를 요약하자면 아래와 같다.

 

Sample
V (ml)
Protein Conc (mg/ml)
Protein Amount (mg)
CV (ml)
Recovery
Lab column
(XK16/40)
Loading
1700
0.5
833.0
40
95.1%
Elution
41.9
18.9
791.9
Process column
(BPG100)
Loading
58700
0.28
16436.0
1600
90.0%
Elution
1720
8.6
14792.0

친화성 수지 컬럼의 경우에는 목적 물질에 대한 선택적인 결합을 하기 때문에 scale up에 있어서 lab scale에서 특정 elution 조건이 잡히게 되면 목적물질과 그 외의 물질간의 크게 2가지 피크로 나타나 scale up이 쉬운 편에 속하며, 해당 크로마토그램을 통해서 동일한 CV 간격에서 유사한 peak가 나오는 것과 이에 대한 protein conc를 측정한 결과 Loading conc이 스케일업시 줄어들었음에도 불구하고 Loading과 elution에서의 목적 단백질의 농도가 약 31~37배 정도로 농축되며, 전체적인 recovery는 약 90%대로 유지되었음을 살펴볼 수 있었다. 이러한 결과와 더불어 목적 단백질의 추가적인 characterization을 통해 해당 시스템을 사용하는 것의 적정성을 평가하게 된다.

 

 

References

Training Material, <Scale up guideline>, GE Lifesciences
Application note 28-9875-25 AA, <Dynamic binding capacity study on MabSelect SuRe™ LX for capturing high-titer monoclonal antibodies>, GE Lifesciences

관련자료

Dynamic Binding Capacity Evaluation

단일클론항체 정제에서 Mabselect Sure를 이용한 용출조건 최적화

Scale up Scenario

Mab Select Sure Elution Optimization using ÄKTA avant DoE

Introduction

A사에서는 CHO cell에서 생산되어 나온 Ab를 정제하기 위해 Mab Select Sure를 주로 사용해 왔다. 그러나 Elution 조건에 대한 Optimization의 필요성이 있어서 ÄKTA Avant150의 DoE 기능을 이용해서 Mab Select Sure의 Elution 조건을 Optimization 하였다.

 

 

Aim and Goal

* Aim: Hitrap Mab Select Sure Elution Optimization
* Goal: Aggregation: 10이하
Protein Amount: 8.5 mg/ml 이상
Purity: 85% 이상

 

 

System, Method and Materials

 

1. System: ÄKTA Avant 150
2. Sample: Clarified CHO feed
3. Column: Mab Select Sure Hitrap 1ml
4. Sample loading: 40 ml with Sample Pump.
5. Working flow rate: 150 cm/h
6. Elution Buffer: Sodium Acetate Buffer
7. Elution Step and Vol : Isocratic, 10 CV

 

 

Design of Experiment

이번 DoE Optimization 에서 사용할 Mab의 경우에 pH와 Salt 농도가 Elution에 영향을 준다는 사실을 A사에서 이미 알고 있었다. 그러나 구체적으로 이 2개의 요인이 특정 범위에서 어떤 영향을 주며, 어떤 optimization 범위를 가지는지는 알 수가 없었기 때문에 Factor(투입)는 pH와 Salt 농도로 하기로 정하였고, Response(산출) 항목으로는 Aggregation, Protein Amount, Purity로 하기로 결정하였다. 한편, 2개의 요인에 대한 범위 값의 구체적인 입력은 Method Editor에서 Purification에 대한 항목을 입력을 한 후, DoE 설정 창에서 아래와 같이 factor의 범위와 Response 항목을 입력하였다.

 

4._Mab_Select_Sure_Elution_Optimization_using_ÄKTA_avant_DoE_1
<Method Editor for setting purification parameters>

 

1. Factor : Elution buffer condition
(1) Elution buffer pH: pH 3.0 ~ 3.8
(2) Elution buffer Salt Concentration: 20mM ~ 100mM
2. Response :
(1) Aggregation
(2) Protein Amount
(3) Purity
3. Transfer Model: Quadratic
(recommended by ÄKTA Avant 150 DoE S/W)
4. RSM Model: CCF 
(recommended by ÄKTA Avant 150 DoE S/W)

 

 

Result

ÄKTA Avant 150 DoE Software상에서 2개 factor (elution pH, elution salt concentration)의 범위를 입력하고, optimization을 선택하였을 때, CCF (Center Composition Face) RSM (반응표면분석법) model을 추천 하였으며(Fig 1), factor 들의 중간 값 3반복을 포함한 총 11번의 Running을 하는 DoE Running Method를 얻었다.(Table 1).
DoE running Method 순서에 따라 다음과 같은chromatography (Fig 2) 및 fraction을 얻고 난 뒤 외부에서 분석하여 각 running에 대한 aggregation, Protein amount, Purity의 값을 얻었다 (Table1).

 

4._Mab_Select_Sure_Elution_Optimization_using_ÄKTA_avant_DoE_2

<Fig 1. Face centered composite design used for experimental setup>

 

4._Mab_Select_Sure_Elution_Optimization_using_ÄKTA_avant_DoE_3

<Fig 2. Chromatogram from HiTrap Mab Select Sure optimizini design>

 

4._Mab_Select_Sure_Elution_Optimization_using_ÄKTA_avant_DoE_4

<Table 1. Design layout of the DoE for optimizing of elution pH, salt concentration and results from the optimization<

 

Aggregation, Protein amount, Purity에 대한 DoE Optimization 분석결과는 다음과 같다.

 

1) Aggregation : 우선 Aggregation에 관한 실험결과가 Quadratic 모델에 얼마나 잘 fitting 이 되는지를 알려 주는 척도인 R2, Q2 값을 살펴보면 R2: 0.96 Q2: 0.88로 실험 결과가 Quadratic 모델에 잘 맞는다는 것을 확인 할 수 있었다. Model validity는 실험결과와 fitting 한 model간의 타당성을 나타내는데, 0.25이상이 되면 신뢰할 수 있는 fitting 결과임을 의미한다. 여기서는 0.89로 타당성이 매우 높다는 것을 알 수 있었다. 재현성(reproducei bility)의 결과도 0.93으로 아주 반복 실험의 재현성이 높음을 확인하였다 (Fig 3).

4._Mab_Select_Sure_Elution_Optimization_using_ÄKTA_avant_DoE_5

<Fig 3. The summary of fit for Aggregation Response >

 

한편, 각 model terms에 관한 coefficient plot을 살펴 보면, elution pH는 낮을 수록, elution salt 농도는 높을수록 Aggregation 수치가 높아 지는데 영향을 주는 것을 확인할 수 있었다 (Fig 4).

4._Mab_Select_Sure_Elution_Optimization_using_ÄKTA_avant_DoE_6
<Fig 4. Coefficients Plot for Aggregation Response>

 

마지막으로 aggregation에 관한 elution pH와 elution salt 농도의 상관 관계를 contour plot으로 확인해 보면, 직선형의 관계가 아닌 곡선형의 상관관계가 있음을 확인할 수 있는 동시에 aggregation 수치가 낮기 위해서는 높은 elution pH와 낮은 elution salt 농도가 필요함을 알 수가 있었다 (Fig 5).

 

4._Mab_Select_Sure_Elution_Optimization_using_ÄKTA_avant_DoE_7
<Fig 5. Contour plot for Aggregation Response>

 

 

2) Protein Amount: R2: 0.97, Q2: 0.95, model validity: 0.9, reproducibility: 0.94 의 결과를 얻었다 (Fig 6).

 

4._Mab_Select_Sure_Elution_Optimization_using_ÄKTA_avant_DoE_8

<Fig 6. The summary of fit for Protein Amount Response>

 

Protein Amount의 optimization 결과도 Quadratic 모델에 잘 맞는 것을 확인 하였다. 각 model terms에 관한 coefficient plot을 살펴 보면, elution pH는 낮을 수록, elution salt 농도는 높을수록 Protein Amount 수치가 높아 지는데 영향을 주는 것을 확인할 수 있었다 (Fig 7).

 

4._Mab_Select_Sure_Elution_Optimization_using_ÄKTA_avant_DoE_9
<Fig 7. Coefficients Plot for Protein Amount Response>

 

더불어 elution pH의 coefficient plot bar 의 길이가 elution salt 농도 bar 보다 길다는 것은 elution salt 농도 보다는 elution pH가 더 Protein Amount에 영향을 준다는 것을 알려 준다. 마지막으로 Protein Amount에 관한 elution pH와 elution salt 농도의 상관 관계를 contour plot으로 확인해 보면, 곡선형의 상관관계가 있음을 확인할 수 있는 동시에 protein amount 수치가 높기 위해서는 낮은 elution pH와 높은 elution salt 농도가 필요함을 알 수가 있었다. 그러나 aggregation optimization 결과와는 약간 다르게 직선형과 유사한 관계를 보여준다 (Fig 8).

 

4._Mab_Select_Sure_Elution_Optimization_using_ÄKTA_avant_DoE_10
<Fig 8. Contour plot for Protein Amount Response>

 

따라서 coefficient plot과 연관해서 살펴보면 protein amount 결과는 elution salt concentration 보다는 elution pH에 더 많은 영향을 받는다고 할 수 있다.

 

 

3) Purity: R2: 0.94, Q2: 0.84, model validity: 0.69, reproducibility: 0.96 의 결과를 얻었다 (Fig 9).

4._Mab_Select_Sure_Elution_Optimization_using_ÄKTA_avant_DoE_11
<Fig 9. The summary of fit for Purity Response>

 

R2: 0.94 로 Quadratic 모델에 잘 맞는 것을 확인 하였고, 각 model terms에 관한 coefficient plot을 살펴 보면, elution pH는 높을 수록, elution salt 농도는 낮을 수록 Purity가 높아 지는데 영향을 주는 것을 확인할 수 있었다(Fig 10). 그리고 protein amount 결과와 마찬가지로 elution pH가 purity optimization결과에 영향을 더 많이 주는 것을 확인하였다.

 

4._Mab_Select_Sure_Elution_Optimization_using_ÄKTA_avant_DoE_12
<Fig 10. Coefficients Plot for Purity Response>

 

 

4) Optimization Region study: Aggregation, Protein Amount, Purity 3가지에 대한 결과를 총합하여, 목표로 삼았던 Aggregation: 10이하, Protein Amount: 8.5 mg/ml 이상, Purity: 85% 이상을 만족하는 조건을 도출 하면, elution pH: 3.7 ~ 3.8, elution Salt 농도: 30 ~ 40 mM 으로 도출이 된다, 이 영역은 각각의 contour plot을 비교, 조합하여 쉽게 알 수 있었다.

 

4._Mab_Select_Sure_Elution_Optimization_using_ÄKTA_avant_DoE_13

<Fig 11. Contour plot for Purity Response>

4._Mab_Select_Sure_Elution_Optimization_using_ÄKTA_avant_DoE_14
<Fig 12. Optimal Area with the following criteria aggregation (<10, protein amount (>8.5mg/ml) and purity (>85%)>

 

 

Summary

A사의 CHO cell에서 생산되어 나온 Ab에 대한 Mab Select Sure를 이용한 elution 조건에 대하여 ÄKTA Avant 150의 DoE 프로그램을 이용하여 Optimization 실험을 수행하였다. 그리고 Aggregation, protein amount, yield의 목표에 도달할 수 있는 Elution pH 와 Salt 농도의 영역을 찾았다. 그리고 이 찾은 영역은 A사에서 사용해 보고자 하는 factor 영역과 거의 일치하는 것으로 나와서 ÄKTA Avant150 DoE 실험이 신뢰할 만하다는 의견이었다. 한편, ÄKTA Avant 150 DoE는 편리한 프로그램 셋팅 법과 다양한 Plot을 보여 줌으로서 DoE 실험 분석을 쉽고 편하게 할 수 있다는 것을 보여 주었다.

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